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【摘要】 目的：探讨Notch2、Jagged-2在缺氧合并高糖大鼠心肌细胞中的表达。方法：选取H9C2细胞（购自中国科学院上海细胞库），进行常规细胞传代培养、冻存，将其随机均分为H9C2（正常组）、缺氧组、高糖组、缺氧+高糖组。H9C2心肌细胞常规培养，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法检测大鼠心肌中Notch2和Jagged-2 mRNA的表达水平，采用Western blot方法检测各组大鼠心肌中Notch2和Jagged-2蛋白的表达水平。结果：缺氧组和高糖组的Notch2、Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：Notch通路在缺氧和高糖刺激下的H9C2心肌细胞中被激活，而缺氧+高糖同时作用于心肌细胞Notch通路的受体和配体表达明显降低。
【关键词】 缺氧; 高糖; Notch2; Jagged-2
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of Notch2 and Jagged-2 in myocardial cells of rats with hypoxia and hyperglycemia.Method：H9C2 cells（purchased from Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences）were subcultured and frozen.They were randomly divided into H9C2（normal group），hypoxia group，hyperglycemia group，hypoxia+hyperglycemia group.The expression levels of Notch 2 and Jagged-2 in rat myocardium were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（Real-time PCR）and the expression levels of Notch2 and Jagged-2 protein in rat myocardium were detected by Western blot.Result：The levels of Notch2 and Jagged-2 mRNA and proteinin in hypoxia group and hyperglycemia group were higher than those of H9C2 group and hypoxia+hyperglycemia group（P<0.01）.Conclusion：Notch pathway is activated in H9C2 cardiomyocytes stimulated by hypoxia and hyperglycemia，while the expression of receptors and ligands of Notch pathway in cardiomyocytes stimulated by hypoxia and hyperglycemia is significantly decreased.
【Key words】 Hypoxia; Hyperglycemia; Notch2; Jagged-2
First-author’s address：Shenyang First People’s Hospital，Shenyang 110041，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.04.005
心血管疾病是糖尿病主要并發症之一，其中心肌梗死合并糖尿病发病率高，症状重，治疗困难、疗效差、死亡率高。长期高血糖可导致糖尿病心脏的多种病理变化，包括心肌的病理改变、冠状动脉粥样硬化、心脏自主神经病变，因此对心肌梗死合并糖尿病的研究在临床工作中尤为重要。Notch信号传导系统在器官和组织的胚胎发育中起着决定性的调节作用，可通过调节细胞增殖、凋亡以及分化过程，在成人生理和病理疾病的发生发展中起到重要作用[1]。目前，研究发现，Notch信号通路参与心肌细胞的发育过程[2-4]。在对小鼠胚胎的发育研究中发现，Notch1在小鼠胚胎发育第11天的心脏中开始表达，表达高峰出现在胚胎第12周;同时Notch2和Notch3的表达趋势与Notch1相似;而Notch4则是在胚胎发育到第2周时在心脏的表达达到最高峰[5]。Notch信号途径在心血管系统疾病以及脂肪肝、胰岛素抵抗等各代谢疾病的炎症发展中也起着重要的作用[6]。Notch信号是调节血管生成的重要因素，促进Notch信号（Dll4）的表达，可以促进血管的生成以及心肌的修复[7]。研究表明，Notch信号通路对于血管的形态学发生很重要，包括动脉、静脉的内皮细胞的分化、变异和修复[8]。另外，在心肌肥厚和心力衰竭模型中特异性敲除心脏Notch1可使心肌肥厚和纤维化加重，心脏功能受损[9]。Notch信号传导系统也可通过促进cyclin D1的表达使未分化成熟的心肌细胞重新进入细胞周期，促进心肌细胞存活、Notch信号传导系统还能够促进骨髓间充质干细胞在心肌梗死部位嵌入，进而促进心脏修复[10]。陈希瑶等[11]研究发现，Notch信号途径对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞具有保护作用。另外有研究发现在小鼠心肌梗死模型中，Notch信号通路通过激活PI3K/Akt信号通路，参与受损后心肌保护和心肌再生过程[12]，并且改善心脏功能、抑制心肌纤维化，同时对促进血管生成也具有重要作用[13]。在体外培养的血管平滑肌细胞中，Notch1的表达与细胞增殖和凋亡密切相关，损伤模型下，细胞增殖降低、凋亡增多，过表达Notch则能促进细胞增殖及抑制细胞凋亡[14-15]。在离体的心肌细胞实验中，检测Notch信号传导系统受体（Notch2）和配体（Jagged-2）在缺氧和高糖环境下的表达情况，从而为临床心肌梗死合并糖尿病患者找到新的治疗靶点提供实验理论依据。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 H9C2细胞购自中国科学院上海细胞库。进行常规细胞传代培养、冻存。本研究在体外培养的H9C2心肌细胞中进行如下实验。
1.2 研究方法 （1）本研究进行随机分组，每组细胞数量为1×106个。①H9C2组（正常组）：置于37 ℃、5% CO2的培养箱内正常培养H9C2心肌细胞;②缺氧组：置于95% N2、5% CO2的培养箱内培养，培养液正常;③高糖组：培养液中加入33 mmol/L的葡萄糖置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养;④缺氧+高糖组：培养液中加入33 mmol/L的葡萄糖置于95% N2、5% CO2的培养箱内培养。各组均培养72 h。（2）心肌细胞Notch2和Jagged-2 mRNA表达水平测定采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）测定[5]。心肌细胞Notch2和Jagged-2蛋白表达水平检测采用Western Blot方法，用凝胶图像处理系统分析目标条带的光密度值[16]。
1.3 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，对数据进行One-way ANOVA分析，结果以（x±s）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 H9C2心肌细胞培养 H9C2心肌细胞常规培养，倒置相差显微镜观察心肌细胞生长状态良好，形态呈长梭形，中心较圆，透明度较好，排列紧密，见图1。
2.2 各组心肌細胞Notch2 mRNA和蛋白表达水平比较 缺氧组和高糖组的Notch2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），H9C2组、缺氧+高糖组的Notch2 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2、表1。
2.3 各组心肌细胞中Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平比较 缺氧组、高糖组的Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），H9C2组、缺氧+高糖组的Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3、表2。
缺氧和高糖都是临床上较为常见的能够损伤心肌的因素，其中缺氧通常导致心肌细胞坏死，而高糖通常导致心肌细胞发生凋亡和心肌纤维化，二者共同作用造成心肌细胞大量减少，从而导致心脏收缩能力减弱，对心脏功能造成损伤。多项研究发现，在心肌梗死后的心肌细胞中，Notch信号通路被激活，并且与心肌细胞损伤后修复密切相关[15-16]。还有研究显示，高糖可以激活Notch信号通路，使Notch1表达升高[17]。但是关于Notch信号通路在缺氧合并高糖作用于心肌细胞的表达情况的研究较少。H9C2心肌细胞是一株可以连续传代的永生化细胞系，容易培养，实验稳定。本实验在心肌细胞缺氧和高糖共同作用下，模拟心肌梗死合并糖尿病对心肌细胞的损伤，探索Notch信号通路在这一过程中的表达情况及增强Notch信号通路对心肌梗死合并糖尿病的心肌细胞的修复作用，为探索心肌梗死合并糖尿病的治疗提供一定的理论基础。
有资料证实，心肌在缺氧性损伤后，Notch信号通路被激活，从而影响心肌细胞的增殖及凋亡等[18]。研究发现，Notch1、2和Jagged-1、2作为Notch信号通路的重要组成部分对心肌细胞发挥重要的保护作用[19]。以往研究也发现，Notch信号通路在缺氧后被激活，Notch1、2增多从而减弱Stat3蛋白发生磷酸化，增加抗凋亡蛋白Bcl-xl生成，下调线粒体凋亡蛋白Bax的表达[20]，从而减少心肌细胞的凋亡。本试验对心肌细胞H9C2在缺氧和高糖处理后的Notch信号通路表达情况进行检测发现，缺氧组和高糖组的Notch2、Jagged-2 mRNA和蛋白表达水平均高于H9C2组、缺氧+高糖组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），证实在缺氧和高糖情况下，心肌细胞H9C2中的Notch信号通路被激活发挥修复心肌细胞的作用;同时发现缺氧+高糖组心肌细胞H9C2中的Notch信号通路部分被激活，Notch2和Jagged-2呈现高表达，同时与单纯缺氧和高糖相比，表达水平也有所降低，推测是有由于缺氧和高糖二者联合作用于心肌细胞，使心肌细胞损伤较重，Notch信号通路的代偿作用减弱，表达降低。
综上所述，本实验证实缺氧和高糖对心肌细胞产生严重的损伤作用，Notch信号通路在受损的心肌细胞中激活发挥心肌保护作用。但是缺氧合并高糖刺激心肌细胞时，由于细胞损伤严重，Notch信号通路的作用也相对减弱。当给予Notch信号通路激动剂后，Notch通路被重新激活，进而对心肌细胞进行修复。因此，Notch信号通路在缺氧合并高糖条件下的心肌细胞的修复中起到十分重要的作用，并且靶向干预Notch信号通路对心肌梗死合并糖尿病的临床治疗具有潜在的应用价值。
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（收稿日期：2018-12-03） （本文編辑：董悦）