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摘 要：为研究镉暴露对食蚊鱼生长发育的影响，将性成熟的雌、雄鱼各50尾，分别静水暴露于4个镉浓度（5，20，100，500 nmol·L-1）试验组中，分别在3，5，8周后取样，对其体长、体质量、肝脏质量和性腺质量进行检测，计算肝腺指数、性腺指数，统计雌鱼不同发育时期的胚胎数，检测雄鱼的精子密度及精子活力等。结果显示，高浓度镉暴露，雄性食蚊鱼的体长、体质量、肝质量、性腺质量等与对照组相比，有明显差异（P<0.01），精子活力与精子数量也明显下降；相对而言，雌性食蚊鱼的生长发育与对照组相比，差别不明显（P<0.05）。结果表明，镉对食蚊鱼具有环境雌激素的生物学效应，镉对雌性食蚊鱼的影响主要是集中在较早的胚胎发育时期。
关键词：镉；静水暴露；生长；胚胎发育；食蚊鱼
中图分类号：O614.24+2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.001
20世纪以来，工业快速发展，镉（Cadmium， Cd）的产量逐年增加。相当数量的镉通过废气、废水、废渣排入水环境，造成污染。污染源主要是铅锌矿，以及有色金属冶炼、电镀和用镉化合物作原料或触媒的工厂。镉的污染主要有气型和水型两种。气型污染主要来自工业废气，镉随废气扩散到工厂周围并自然沉降，蓄集于工厂周围的土壤中，可使土壤中的镉浓度达到40 μmol·L-1，污染范围有的可达数公里。水型污染主要是铅锌矿的选矿废水和有关工业（电镀、碱性电池等）废水排入地面水或渗入地下水引起[1]。镉作为一种非降解且有蓄积性的污染物，因其毒性大、应用广泛而成为主要的重金属污染物。在低浓度镉水环境中暴露即可对鱼类产生毒性效应及其他生物学效应，导致鱼类各组织器官出现损害，从而对其生长发育及生殖造成影响。由于镉的毒性累积，水生动物的镉含量也日渐增加。人食用含镉的鱼类或植物时，镉便会通过食物链进入人体。人摄入镉被人体吸收后，排出非常缓慢，在人体的生物半衰期很长，约为16～38年[2-3]。镉在人体的肾和肝脏中蓄积，造成积累性中毒，可能引发癌症。
近年来，水污染问题已受到广泛的关注。鱼类生活于水中，通过鱼类的多样性和种群变化情况可以推断水环境状况，即利用鱼类监测水质的变化，所以鱼类是水域污染的活的“监测器”。评价水污染的程度，急性毒性的数据与资料是最为常用的依据之一，然而污染物质对水生生物的潜在危害往往是有毒物质低浓度长时间的暴露。由于慢性毒性试验周期长、耗资大，如何缩短试验周期就成为人们关注的问题。一些研究发现胚胎和幼鱼是鱼类最敏感的生活阶段，在20世纪70年代末提出了早期生活阶段试验，然而进行早期生活阶段试验仍需30～90 d[4-5]。为进一步探索缩短试验周期方法，有学者发展了黑头软口鲦（Pimephales promelas）7 d亚慢性试验[6]，ISO提出了短期早期生活阶段试验[7]。用鱼类早期发育阶段试验的结果来预报化学物质对鱼类可能产生的影响，这样就大大缩短了试验的持续时间，为评价化学物质对鱼类的影响提供了比较快速的试验方法。
西部食蚊鱼（Gambusia affinis）是一种小型卵胎生鱼类，为了消除蚊子和疟疾，于19世纪初便从北美和中部美洲引入到世界各地。食蚊鱼的入侵性非常强，并具有高繁殖力，对其所在的生态系统具有关键的生物效应。这个物种对温度和盐度的变化有较强的适应能力，这使其能在不同的生态环境中存活。由于以上的特性，食蚊鱼广泛分布于各地，容易捕捞，易于在实验室进行毒性暴露试验，因此被广泛用于生物指示种类。本课题利用食蚊鱼作为试验动物，在实验室条件下，将其暴露于不同浓度的镉水环境中，通过在试验期间检测到的食蚊鱼的体长、体质量、性腺（卵巢和精巢）等一系列指标作为生殖发育的重点指标。在个体的水平上，研究不同浓度的镉溶液对食蚊鱼生长和胚胎发育的影响，为环保部门提供有科学价值的基础数据和资料。
1 材料和方法
1.1 试验动物
食蚊鱼购买于广州市花地湾花鸟市场，挑选性成熟的食蚊鱼，并将雄鱼与雌鱼进行分别鉴定：雄鱼平均体长35 mm，具有生殖鳍（交配足），且鳍上具钩的为性成熟的雄鱼个体；雌鱼体长35～60 mm，无生殖鳍结构。将选好的性成熟雄鱼与雌鱼分别放在玻璃水缸里驯养3～4周，定时喂食。驯养完成后，将一定数量的雄鱼与雌鱼置于不同浓度的镉静水环境中，定时喂食。每隔一段时间，观察食蚊鱼的生长状况并测量其生殖指标。
1.2 试验药品和仪器
KCL溶液、台盼蓝染色液等。玻璃鱼缸、网罩、气泵各5个，渔网和备用鱼缸。标准刻度尺、解剖镜、解剖针、解剖盘和分析天平。电子显微镜、血球计数板、移液枪和PCR管、冰盒、镊子、玻片和记号笔等。
1.3 试验条件
试验用水为曝气24 h的自来水。养殖和暴露期间的条件控制：水温25～28 °C，试验期间每天分别在9：00、18：00各投喂1次剪碎的红虫（Tendipes sp.larvae），每次投喂1 h后清除残饵，3 d换水1/3。
1.4 试验方法与步骤
1.4.1 镉暴露对食蚊鱼生长和胚胎发育的影响 选用性成熟的雌、雄食蚊鱼各250尾，雌、雄食蚊鱼相隔离，先置室内驯养3～4周后进行镉暴露试验，暴露周期分别持续5周和8周。暴露试验分组设定：（1）不加镉的半静水对照组；（2）镉试验组，设定5，20，100，500 nmol·L-1共4组，每组试验鱼50尾，用15 L的水进行养殖。半静水暴露，每组浓度梯度和饲养条件完全一致。每隔3 d换掉1/3半静水，并加镉使之保持设置的浓度，使用原子吸收分光光度计（Z-2000）进行监测。在暴露期间，于第3周、5周和8周后随机选取雌、雄鱼各6条进行解剖。在解剖前测量鱼的全长、体质量，剖后测量肝脏质量和性腺质量，计算肝腺指数和性腺指数，并制作石蜡切片对雌鱼的卵巢进行组织学观察。根据食蚊鱼胚胎发育12个时期进行胚胎数量的统计，测定雄鱼的精子数量和精子活力。
1.4.2 雌鱼繁殖体鉴别与统计 解剖雌鱼，取出完整的卵巢，在体式显微镜下用解剖针解剖观察，进行食蚊鱼的胚胎发育时期划分。参照Edward[8]对食蚊鱼胚胎发育分期的描述，将食蚊鱼胚胎发育划分为12个阶段：Stage0：卵细胞处于生殖静止期；Stage1～Stage2：卵细胞开始积累卵黄颗粒；Stage3：第1次出现所有的卵大小一致的状况；Stag4：囊胚出现透明点；Stage5：胚胎延长，但未出现色素；Stage6：开始出现眼睛的黑色素；Stage7：体积变大，眼睛明显但尚未发育完全；Stage8：胚胎开始出现发育完全和色素充足的眼睛、皮肤，但是尾巴还没有和头部分开；Stage9：胚胎依然保留巨大的卵黄囊，但是尾巴已经和头部分开；Stage10：卵黄已经被吸收，若此时的胚胎离开母体，已经具备生存能力；Stage11：卵黄被吸收，准备离开母体。统计雌鱼各个时期的胚胎数，将其记录下来。
1.4.3 测定雄鱼的精子数量 精荚的获取：从解剖的鱼体中取出性腺，放在干净的培养皿中，用镊子破碎取出精荚，然后用2.5 μL的移液枪迅速吸入成熟的精荚，在吸入精荚之前须知道吸入的精荚精确数目，将吸取的精荚放入PCR管（每个浓度3个重复），并加入KCl使之体系增加到50 μL，此时用移液枪反复吸打20次，使精荚破裂并充分混合。
数量的统计：从PCR管中吸取1 μL液体，滴在血球计数板的格子部位，盖上盖玻片开始计数。将显微镜下看到的血球计数板的上、下、左、右、中5大方格子里的精子数目记录下来。
精子数量的计算公式为：
由此公式求得样品平均每个精荚中所含精子数量。
1.4.4 精子活力统计 取定量的成熟精子，置于PCR管中，加入台盼蓝染液使之浓度达到0.5%。染色10 min后，用移液枪吸取1 mL悬液滴在载玻片上。盖上盖玻片，在显微镜下根据染色结果进行统计。被台盼蓝染成蓝色的是死精子细胞，通过计算活细胞/总细胞数目可评价精子的活力。
1.4.5 数据统计与分析 采用SPSS17.0统计软件对数据进行各种检验和比较。采用独立样品T检验进行数据显著性差异分析。当P<0.05时，认为差异显著；当P<0.01时，认为差异极为显著。
2 结果与分析
2.1 镉暴露对性成熟雄性食蚊鱼生长及生殖发育的影响
由表1可见，不同浓度的镉暴露3周和5周后对雄性食蚊鱼的生长和发育有不同程度的影响。
镉暴露3周后，低浓度组（5 nmol·L-1）与对照组相比，体质量、肝质量、精子数量有明显差异（P<0.05），其它指标无差异；较低浓度组（20 nmol·L-1）体质量、体长、肝质量和肝腺指数均无差异，但性腺质量、性腺指数、精子数量、精子成活率均出现明显差异（P<0.05，P<0.01），尤其是雄鱼的精子成活率有显著差异（P<0.01）；较高浓度组（100 nmol·L-1）体长、体质量、肝腺指数、性腺指数、精子数量与对照组相比无差异（P<0.05），而肝质量、性腺、精子成活率有显著差异（P<0.05，P<0.01）；高浓度组体质量、性腺质量、性腺指数均出现明显差异（P<0.05）。暴露5周后，镉对雄性食蚊鱼的影响比暴露3周的影响要大一些。从表中数据来看，雄性食蚊鱼的体长、体质量、性腺质量、精子数量、精子成活率均有所下降，且下降的幅度要比3周的大，而肝质量与肝腺指数有所增大。由以上数据可看出，经镉暴露后，5～100 nmol·L-1的镉半静水环境对性成熟雄性食蚊鱼的生长影响较小；高浓度的镉半静水环境对性成熟雄性食蚊鱼的体质量、性腺影响较大，也影响到雄鱼的生殖力。在所有测量指标中，雄性食蚊鱼的精子成活率对镉水环境的浓度最为敏感。在浓度为20 nmol·L-1时，精子活力已经出现明显下降的现象。
2.2 镉暴露对性成熟雌性食蚊鱼生长及生殖发育的影响
由表2可见，不同浓度的镉暴露对雌性食蚊鱼的生长和生殖发育有不同程度的影响。
与对照组相比，低浓度组（5 nmol·L-1）的体长、体质量、肝质量、性腺质量、肝腺指数都有明显下降的现象，性腺指数稍有上升；从其他浓度组来看，雌性食蚊鱼的各项指标随着镉浓度的增大变化更趋明显，尤其是高浓度的镉极明显地损伤了雌鱼的生长机制和生殖系统，性腺质量大大减小。
2.3 镉暴露对雌性食蚊鱼胚胎发育的影响
由图1 A、B和C可见，镉暴露3、5和8周后对雌性食蚊鱼的胚胎发育影响相一致，表现为对其早期阶段的胚胎发育影响较明显，并且随着镉浓度的增加，0～3期胚胎数减少的情况比较显著（P<0.05）。而越到胚胎发育的后期，镉对食蚊鱼胚胎的伤害就越小。在胚胎发育的后期，试验组与对照组的胚胎数无明显差异，都维持在较稳定的水平上。这些数据皆表明，镉对雌性食蚊鱼胚胎发育的影响，主要集中在对食蚊鱼早期胚胎发育时期的损害上，而中晚期胚胎的防御能力增强，能够抵抗一定程度的镉毒害作用。
3 结论与讨论
随镉浓度的增大，镉对性成熟的食蚊鱼生长发育的影响更加明显。在高浓度的镉半静水环境中，雄性食蚊鱼的体长、体质量、肝质量、性腺质量等与对照组相比，有明显差异，主要表现为体长减小、体质量减轻、肝质量增大、性腺质量减小，而雄性食蚊鱼的精子活力与精子数量也明显下降。随着时间的推移，这种差异的程度更加显著，在试验的第8周时，雄性食蚊鱼全部死亡。相对雄性而言，雌性食蚊鱼的生长发育与对照组相比，差别不明显。结果表明，镉具有环境雌激素的生物效应，对雄性食蚊鱼的影响比雌性食蚊鱼更加明显；镉对雌性食蚊鱼胚胎发育的影响主要是集中在较早的胚胎发育时期，中晚期的胚胎发育则比较稳定。
3.1 镉对鱼类生长发育的影响
与对照组相比，无论是雄性食蚊鱼还是雌性食蚊鱼，通过5周或8周的暴露试验，其体长、体质量均明显减轻。这是因为镉能够影响食蚊鱼体内的消化酶活性，其机制可能为：重金属离子直接与消化酶活性中心上的咪唑基、巯基、氨基等功能集团结合，抑制酶的活性，或酶的非活性中心部分与重金属离子结合，使结构发生改变，酶活性减弱[9]。
肝脏是动物体内的主要解毒器官，也是污染物蓄积和产生毒害作用的主要靶器官之一。当鱼体暴露于有毒的水环境中，由于氧化胁迫的作用，肝脏等组织器官将通过抗氧化系统酶活性的诱导去进行自身的保护，某些代谢酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等可能被诱导或抑制，进而导致代谢物在肝细胞内积累，将可能引起鱼体的肝细胞肿大、肝腺指数（HIS）升高[10]，本研究结果也证明了这一点，经过5～8周镉暴露，雌雄鱼肝质量有不同程度增加。
3.2 镉对雄性食蚊鱼性腺发育的影响
镉半静水环境对雄性食蚊鱼的性腺发育造成一定程度的损伤，高浓度的镉半静水暴露还会使得雄性性腺萎缩，生殖力下降。在试验过程中，雄性食蚊鱼比例不断减少，在高浓度的镉半静水环境中尤为明显。这是因为镉还具有环境雌激素及环境内分泌干扰物质的效应[11-12]，它通过直接或间接作用于某些重要基因如癌基因或抑癌基因，以及细胞中其他的信号途径如离子通道、细胞第二信使系统等方面而起作用。这种镉的类雌激素作用可以干扰雄性激素水平，有效地影响雄性食蚊鱼的生长和发育。由于雄性食蚊鱼的性腺发育受抑制，其能量就会储存在肝脏和肌肉中，这使肝脏有更多的能量用于自身的解毒和修复[13]。性腺发育受到抑制，体内相关的激素水平也会降低，从而造成精子数量和精子活力的下降[14]。
3.3 镉对雌性食蚊鱼性腺发育和胚胎发育的影响
镉具类雌激素活性作用，能够诱导食蚊鱼胚胎凋亡，使胚胎产生畸形。镉在鱼体内累积，因身体各部位代谢功能不同，其主要累积在内脏部位，其中肝脏和性腺尤为明显。镉对雌性食蚊鱼的肝脏和性腺的影响不如对雄性食蚊鱼的强烈。在鱼类的整个生活周期中，胚胎期和幼鱼早期发育阶段对重金属镉污染最为敏感。镉作为一种环境雌激素，可以模拟性激素的作用，与体内相应受体结合，从而激活受体引发相应的生物效应，或阻断以及减少体内性激素的受体结合力和生物活性。因此，镉能够干扰鱼体内的内分泌水平，能与含羧基、氨基特别是含巯基的蛋白质分子结合，如与组织蛋白羧基形成不溶性金属蛋白盐，与巯基形成稳定的金属硫醇盐，导致许多酶系统的活性受到抑制和破坏，丧失了酶系正常生理功能[15]。此外，镉还会对胚胎产生一定的毒害作用，可能引起胚胎内的染色体畸形或者对胚胎细胞的直接毒害。胚胎的每一发育时期，其承受能力也是一定的，一旦超过安全浓度，胚胎便可能发生凋亡现象。胚胎发育时期越早，这种毒害作用越明显。
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