摘要 [目的]研究大黃对仿刺参非特异性免疫的影响。[方法]通过在饵料中添加2%、5%和10%不同比例的大黄粉来投喂仿刺参，分析其体腔液中溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）及酸性磷酸酶（ACP）的酶活变化情况。[结果]LSZ活性在第21天时，3个剂量组分别较空白组提高了92.86%、96.43%和90.10%，酶活达到最高；SOD活性在第7天时，3个剂量组分别较空白组提高了4.36%、8.87%和9.28%；AKP活性，2%和5%剂量组均低于空白组，10%剂量组在第21天时达到最高值，其酶活与空白组差异极显著（P<0.01）；2%和5%剂量组分别在第21、28天时ACP酶活达到最高，但与空白组间的差异不显著（P>0.05），10%剂量组在第14天时酶活达到最高，与空白组间的差异极显著（P<0.01），大黄对ACP活性的影响与添加剂量不呈正相关。[结论]拌饵投喂不同剂量的大黄对仿刺参体腔液中4种酶的影响不同：10%剂量组提高酶活的时间要早于2%和5%剂量组，因此建议拌饵投喂2%和5%大黄的饲料21 d或10%大黄的饲料14 d，可提高仿刺参的非特异性免疫，但持续投喂时间不宜过长，停止投喂14 d左右各免疫指标可恢复至平常水平。
关键词 大黄；仿刺参；溶菌酶；超氧化物歧化酶；碱性磷酸酶；酸性磷酸酶
中图分类号 S963.73 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0057-04
Abstract [Objective]Effects of rhubarb on nonspecific immunity of Apostichopus japonicas were studied.[Method]By the addition of 2%，5% and 10% in different proportions to rhubarb feeding A. japonicas，the lysozyme （LSZ），superoxide dismutase （SOD），alkaline phosphatase （AKP） and acid phosphatase （ACP） enzyme activity in coelomic fluid of A. japonicas were analyzed.[Result]At day 21，LSZ activity was highest，increased by 92.86%，96.43% and 90.10% in the three dose groups，respectively，compared with the blank group.At day 7，SOD activity increased by 4.36%，8.87% and 9.28% in the three dose groups，respectively，compared with the blank group.AKP activity was lower in the 2% and 5% dose groups than in the blank group，and the 10% dose group reached the maximum value on day 21. Significant difference in enzyme activity between the dose group and the blank group （P<0.01）.ACP activity was the highest in the 2% and 5% dose groups at day 21 and 28，respectively，but the difference between them and the blank group was not significant （P>0.05）.10% dose group had the highest enzyme activity on day 14，and the difference between the 10% dose group and the blank group was significant （P<0.01）.The effect of rhubarb on ACP activity was not positively correlated with the added dose. [Conclusion]Different doses of rhubarb mixed with bait have different effects on 4 kinds of enzymes in cavity fluid of A. japonicas.The 10% dose group increased enzyme activity earlier than the 2% and 5% dose groups.Therefore，it is recommended to feed 2% and 5% rhubarb with baits for 21 days or 10% rhubarb for 14 days，which can improve the nonspecific immunity of A. japonicas.However，the duration of continuous feeding should not be too long，stop feeding 14 days，all immune indexes can be restored to normal level.
Key words Rhubarb；Apostichopus japonicas；Lysozyme；Superoxide dismutase；Alkaline phosphatase；Acid phosphatase
大黄是一种具有多种免疫作用的药用植物。胥楠等[1]通过对比小鼠灌胃生理盐水和大黄煎剂后肠道内的IgA、总蛋白、补体C3、高密度脂蛋白（HDL）以及Ⅱ型磷脂酶A2活性和溶菌酶的含量，发现大黄能促进肠黏膜上皮分泌多种免疫相关物质。孙丽霞等[2]研究也表明大黄煎剂对小鼠特异性及非特异性免疫均有促进作用。目前，大黄及大黄制剂已被广泛应用于水产养殖生产中。陈孝煊等[3]曾报道，投喂含1%大黄水提取物的饲料可以明显提高异育银鲫血清和体表黏液溶菌酶的活性，且体表黏液溶菌酶活性远远高于血清中的溶菌酶活性；苏永腾等[4]添加4种不同剂量的大黄蒽醌提取物，拌饵投喂罗氏沼虾发现其可有效提高罗氏沼虾机体免疫力，降低其对病原菌敏感性，提高罗氏沼虾抗病力；李素莹等[5]和王芸等[6]以凡纳滨对虾为研究对象，分别将大黄粉和大黄水提取物添加到饲料中，结果表明二者均可显著提高凡纳滨对虾的免疫力。但大黄如何影响仿刺参的免疫系统鲜见报道。笔者通过拌饵投喂不同剂量的大黄粉，研究其对仿刺参体腔液中的溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）以及酸性磷酸酶（ACP）活性的影响，探讨大黄对仿刺参非特异性免疫的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器。Anke TGL-16C离心机；DS-300电子天平；海尔BCD-206TD -20 ℃冰箱；水浴锅；751型分光光度计；Backman DU640紫外可见分光光度计等。
1.1.2 试剂。大黄于粉碎机中粉碎后拌饵投喂（颗粒大小为100目左右），经测定大黄粉中大黄酸含量为3.67 mg/g；酶活测定试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所；化学分析纯冰乙酸等。
1.2 药饵配制及分组
将仿刺参随机分为3个剂量组和1个空白对照组。3个剂量组，即分别在空白饲料中添加2%、5%、10%的大黄粉；空白对照组，投喂比例为1∶1的鼠尾藻和海泥。每组设4个平行，每组8头仿刺参，每2头仿刺参的体腔液合为1个样品。
1.3 材料及饲养管理
试验用健康仿刺参（Apostichopus japonicus）购买于山东青岛即墨某仿刺参养殖场，平均体重（38.9±4.3） g，试验期间饲养于即墨鳌山卫试验基地，将4组仿刺参分别饲养于4个35 L的PVC桶中，试验前暂养7 d，暂养期间全部投喂空白饲料，之后投喂含大黄粉的相应药饵。养殖期间，水温（13.0±0.5）℃，pH7.8±0.1，盐度31±1，每天投饵时间16：00，投饵量约为5%仿刺参总体重，次日09：00換水，换水时将全部海水换掉并清理残饵粪便，24 h不间断连续充氧，养殖时间为42 d。
1.4 仿刺参体腔液的采集
在试验开始后，各组按相应剂量投喂28 d，之后全部投喂空白饲料14 d，于第7、14、21、28、42天自仿刺参的右侧口后1/3处，使用1 mL的无菌注射器穿刺抽取体腔液0.25 mL，将每2头仿刺参的体腔液合为1个样品，离心分离其上清液，-20 ℃冰箱保存备用。
1.5 免疫相关酶活性测定
1.5.1 溶菌酶（LSZ）活性测定。溶菌酶活性采用试剂盒中的空白对照法测定。取0.2 mL仿刺参体腔液，加入2 mL应用菌液混匀，置于37 ℃的水浴锅中水浴15 min，立即取出置于0 ℃冰水浴中3 min，逐管取出倒入1 cm光径比色皿中，利用751型分光光度计，在530 nm处以蒸馏水调节透光度100%，比色测定样品的透光度值。另取0.2 mL蒸馏水和200 U/mL（即2.5 μg/mL）的溶菌酶标准应用液按上述方法处理，得到空白透光度值和标准透光度值。计算公式如下：
溶菌酶活性（U/mL）=（样品透光度值-空白透光度值）/（标准透光度值-空白透光度值）×200。
1.5.2
超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性的测定。SOD、AKP和ACP活性均按照试剂盒中方法测定。
1.6 数据处理
利用SPSS13.0软件，对测得数据进行单因素方差分析（oneway ANOVA），试验结果以平均数±标准误差的形式表示，当P<0.05时表示数据间差异显著。利用Sigmaplot 10.0绘图。
2 结果与分析
2.1 大黄对仿刺参体腔液中溶菌酶（LSZ）活性的影响
由图1可知，各剂量组中酶活性均呈现随用药时间推移先升高后降低的趋势。在第21天前，2%剂量组和5%剂量组中酶活性均小于空白组，且2%剂量组在第14天时与空白组酶活性差异显著（P<0.05），5%剂量组在第14天时酶活性与空白组酶活性差异显著（P<0.05）；10%剂量组酶活性始终高于空白组，在第7天时酶活性较空白组提高了1倍。在第21天时，酶活性达到最高，各剂量组相对于空白组酶活性分别提高了92.86%、96.43%和90.10%，但此时剂量组与空白组之间差异不显著（P>0.05），这可能与仿刺参存在个体间差异有关。随着时间的推移（t>第21天），各剂量组与空白组酶活性之间的差距越来越小，在停止投喂药饵14 d（即第42天）时，剂量组酶活性接近且略高于空白组。
2.2 大黄对仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
由图2可知，2%剂量组和5%剂量组中酶活性呈现随用药时间增加先升高后降低的趋势，在第21天达到最大值，10%剂量组酶活呈降低趋势。酶活性在第7天时，3个剂量组分别较空白组提高了4.36%、8.87%和9.28%；连续给药28 d，第28天时各剂量组酶活开始低于空白组，且差异性显著（P<0.05），停止投喂药饵14 d（即第42天）时，酶活又恢复到与空白组接近的水平。
2.3 大黄对仿刺参体腔液中碱性磷酸酶（AKP）活性的影响
由图3可知，给药期间，2%剂量组在第21天时酶活达到最高值，但始终低于空白组；5%剂量组在第28天时酶活达到最高值，此时酶活接近空白组，为空白组酶活的97.22%；10%剂量组在第21天时酶活达到最高值，为空白组酶活的6.99倍，与空白组间的差异极显著（P<0.01）。停止投喂药饵14 d（即第42天）时，各剂量组的酶活接近空白组。
2.4 大黄对仿刺参体腔液中酸性磷酸酶（ACP）活性的影响
由图4可知，大黄对酶活的影响与剂量不呈正相关，2%和5%剂量组分别在第21、28天达到最高，但与空白组间的差异不显著；10%剂量组在第14天时酶活达到最高，为空白组酶活的8.61倍（P<0.01）。停止投喂药饵14 d（即第42天）时，各剂量组的酶活接近空白组。
3 讨论
3.1 溶菌酶（LSZ）活性 LSZ广泛存在于动植物体的各种组织、血液和分泌物中，是吞噬细胞杀菌的物质基础，也是生物体内重要的非特异性免疫因子之一。LSZ在海洋无脊椎动物中具有防御病害的作用[7]。此外，Jollès等[8]报道LSZ对一些海洋细菌还具有消化、滤食的作用。试验中2%和5%大黄剂量组LSZ酶活在第21天达到最高，10%剂量组在第7天比空白组酶活高了1倍，大黄能够提高仿刺参体腔液中LSZ的活性，这与近年来大黄对LSZ活性影响的报道相似。蔡中华等[9]报道鲤鱼摄食含有大黄提取液的饲料后各组织中的溶菌物质增多，吞噬率、吞噬指数明显提高；王芸等[6]报道大黄提取物能够提高凡纳滨对虾LSZ活性，大黄也能增强克氏原螯虾（Procambarus clarkii）和红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）血细胞的吞噬活性[3]。试验结果中，相对于空白组酶活，10%剂量组达到最强酶活的时间早于2%和5%剂量组。2%和5%剂量组的LSZ酶活在第7、14天时低于空白组，之后高于空白组。造成这种现象的原因可能是以下两点：第一，大黄对副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、嗜水气单胞菌等水中常见菌具有较强的抑菌效果[10-11]，该试验采用的是大黄混合鼠尾藻粉和海泥的拌饵投喂方式，投喂后一部分大黄溶于水中，相对于空白组，2%和5%剂量组的海水中致病菌的量较少，减少了环境中引起仿刺参免疫应答的刺激。第二，仿刺参前肠中大量的微生物来源于食物中的藻类碎屑，在前肠中见到的大量弧菌和假单胞菌也是海藻和海泥中常见的类群[12]。大黄能促进肠道蠕动，增加肠道对细菌和毒素的排除作用[1]，减少了其自身体内免疫的刺激物，但其剂量还达不到10%剂量组作为外源物刺激仿刺参立即引起免疫反应，但随着时间的延长，大黄对仿刺参持续的刺激会引起仿刺参的免疫反应，从而使得后期酶活高于空白组。
3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性
SOD是生物体各组织中重要的抗氧化酶。Regoli等[13]认为物种对环境突变的适应能力还取决于它产生的抗氧化物能力。各剂量组第28天时的酶活均低于空白组，差异显著（P<0.05）。其原因可能是以下两点：第一，陈忻等[14]认为大黄具有清除超氧自由基的作用，起到抗自由基损伤的功效。该试验中大黄能减少仿刺参体内自由基的含量，发挥抗氧化作用，导致诱导性酶SOD活性降低。第二，长时间投喂大黄，产生了“免疫疲劳”。Ai等[15]和Scholz等[16]的研究显示长期投喂β-葡聚糖不仅不能提高动物的生长性能，而且会使饲养动物出现免疫抑制现象，这与中医所说的“久服大黄则苦寒伤脾，脾虚则免疫功能低下”一致[17]。该研究结果显示，停止喂药14 d后各剂量组仿刺参的SOD活性恢复到正常状态。
3.3 碱性磷酸酶（AKP）活性
AKP是生物体内的一种重要的代谢调控酶[18]，它对底物的专一性要求较低，是一种重要的解毒系统，并与一些营养物质的消化吸收有关[19]。2%和5%剂量组的大黄对仿刺参的AKP具有抑制作用，其原因可能类似于第7、14天大黄对溶菌酶的抑制作用。在第21天时10%剂量组的大黄作为外源刺激物对仿刺参的AKP具有强烈的免疫提高作用，为空白组酶活的6.99倍，与空白组间的差异极显著（P<0.01）。在养殖的前21 d，仿刺参体腔液中的AKP活性随着大黄添加量的增多也相应提高，这与聂月美[20]研究维生素C的添加量与中华鳖血浆中AKP活性的影响关系类似。
3.4 酸性磷酸酶（ACP）活性
ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，起到预防感染，加快对异物的识别、吞噬和清除速度的作用[21]。ACP可以被外源刺激物激活[22]，柯浩等[23]报道大黄占最大比例的复方中草药能够维持杂色鲍血淋巴较高的ACP水平。该试验中3个剂量组的最高酶活分别为空白组的3.55倍、3.79倍和8.61倍，表明大黃可以提高仿刺参体腔液中ACP活性。
4 结论
拌饵投喂不同剂量的大黄对仿刺参体腔液中4种酶的影响不同：2%和5%剂量组的大黄对LSZ前14 d具有抑制作用，对AKP具有抑制作用，其原因可能是大黄减少了引起仿刺参免疫指标上升的刺激物，10%能提高LSZ和AKP酶活。各剂量组的大黄都能提高SOD、ACP活性，但长时间的投喂会抑制SOD酶活。综合来看，10%剂量组提高酶活的时间要早于2%和5%剂量组，因此建议拌饵投喂2%和5%大黄的饲料21 d或10%大黄的饲料14 d，可提高仿刺参的非特异性免疫，但持续投喂时间不宜过长，停止投喂14 d左右各免疫指标可恢复至平常水平。
参考文献
[1] 胥楠，陈晓理，芦灵军，等.大黄对小鼠肠道免疫分泌物的影响[J].中国中药杂志，2005，30（18）：1441-1443.
[2] 孙丽霞，任金荣，单保恩，等.大黄制剂对小鼠的急性毒性和自然免疫调节作用[J].癌变·畸变·突变，2006，18（1）：35-37.
[3] 陈孝煊，吴志新，殷居易，等.大黄、穿心莲、板蓝根和金银花对异育银鲫免疫机能的影响[J].中国水产科学，2003，10（1）：36-40.
[4] 苏永腾，刘波，周群兰.大黄蒽醌提取物对罗氏沼虾抗鳗弧菌感染的研究[J].水产学报，2008，32（3）：455-463.
[5] 李素莹，周歧存.大黄对凡纳滨对虾生长和非特异性免疫指标的影响[J].广东海洋大学学报，2009，29（6）：36-41.
[6] 王芸，李健，刘淇，等.5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响[J].安徽农业科学，2007，35（26）：8236-8239.
[7] HIKIMA S，HIKIMA J，ROJTINNAKORN J，et al.Characterization and function of kuruma shrimp lysozyme possessing lytic activity against Vibrio species[J].Gene，2003，316：187-195.
[8] JOLLS P，JOLLS J.What"s new in lysozyme research？ Always a model system，today and yesterday[J].Molecular and cell biochemistry，1984，63（2）：165-189.
[9] 蔡中華，陈成勋，邢克智，等.四种中药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响[J].天津农学院学报，1998，5（2）：31-34.
[10] 张明，王建华，赵毅，等.20味中药对鳗弧菌的药敏试验[J].动物医学进展，2005，26（8）：77-79.
[11] 周群兰，郑小平，刘波，等.大黄提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果[J].江苏农业科学，2007（2）：64-66.
[12] 孙奕，陈騳.刺参体内外微生物组成及其生理特性的研究[J].海洋与湖沼，1989，20（4）：300-307.
[13] REGOLI F，CERRANO C，CHIERICI E，et al.Seasonal variability of prooxidant pressure and antioxidant adaptation to symbiosis in the Mediterranean demosponge Petrosia ficiformis[J].Marine ecology-progress series，2004，275（1）：129-137.
[14] 陈忻，周建平，李玉红.大黄等中药抗自由基损伤研究[J].北京中医，1995（5）：48-49.
[15] AI Q H，MAI K S，ZHANG L，et al.Effects of dietary β1，3 glucan on in innate immune response of large yellow croaker，Pseudosciaena crocea[J].Fish&shellfish immunology，2007，22（4）：394-402.
[16] SCHOLZ U，GARCIA DIAZ G，RICQUE D，et al.Enhancement of vibriosis resistance in juvenile Penaeus vannmei by supplementation of diets with different yeast products[J].Aquaculture，1999，176（3/4）：271-283.
[17] 樊永平，周勇，严宣左.大黄水煎液对小鼠免疫功能的影响[J].中国中医药科技，1995，2（2）：24-25.
[18] 陈清西，陈素丽，石艳.长毛对虾碱性磷酸酶性质[J].厦门大学学报（自然科学版），1996，35（2）：257-261.
[19] ZHANG R Q，CHEN Q X，ZHENG W Z，et al.Inhibition kinetics of green crab（Scylla serrata）alkaline phosphatase activity by dithiothreitol or 2mercptoethanol[J].Theinternational journal of biochemistry and cell biology，2000，32（8）：865-872.
[20] 聂月美.饲料维生素C对中华鳖免疫、抗应激和体组成的影响[D].杭州：浙江大学，2006：20-30.
[21] CHENG T C.The role of Lysosimales in molluscan cellular response to immunologic challeng[J].Comparative pathology，1978，4：59-71.
[22] MENG Z，SHAO J Z，XIANGL X.CpG oligodeoxynucleotides activate grass carp（Ctenopharyngodon idellus）macrophage[J].Dev Comp Immunol，2003，27（4）：313-321.
[23] 柯浩，王江勇，彭绪运，等.复方中草药对杂色鲍幼鲍血淋巴中几种酶活力的影响[J].海洋水产研究，2004，25（5）：74-79.