[摘要] 目的 观察17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯（DHEA）联合环磷酰胺（CTX）对接种L615白血病细胞小鼠的治疗作用。 方法 将接种L615白血病细胞的小鼠分为对照组、CTX组、DHEA（低、中、高）剂量组、DHEA（低、中、高剂量）联合化疗（CTX）组，连续给药9、12 d后分别检测肿瘤抑制率、外周血细胞数、骨髓有核细胞数、胸腺与脾指数等指标。 结果 DHEA低、中、高剂量组，CTX组以及DHEA（低、中、高剂量）联合CTX组瘤重均低于对照组，抑瘤率分别为45.40％、67.94％、50.48％、70.48％、69.21％、75.87％及72.06％，与对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA中剂量组瘤重均低于DHEA低剂量组及DHEA高剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。DHEA低、中、高剂量组的白细胞数[（15.87±3.32）×109、（17.92±1.79）×109、（18.55±3.21）×109/L）]及DHEA联合CTX各组的白细胞数[（16.72±2.67）×109、（18.98±2.34）×109、（19.65±2.79）×109/L）]均高于对照组[（13.32±2.56）×109/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组及DHEA联合CTX各组的白细胞数均高于CTX组[（10.56±1.83）×109/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组的骨髓有核细胞数[（8.28±2.12）×106、（9.93±1.36）×106、（8.22±1.91）×106/股骨]及DHEA联合CTX各组的骨髓有核细胞数[（7.55±1.13）×106、（8.67±2.21）×106、（7.96±1.46）×106/股骨]均高于对照组[（6.34±1.21）×106/股骨]，差异有统计学意义（P < 0.05）。DHEA中剂量组的骨髓有核细胞与CTX组[（7.92±0.89）×106/股骨]比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组及DHEA联合CTX各组的胸腺和脾脏指数均高于对照组，与对照组比较差异均有高度统计学意义（均P < 0.01)。 结论 DHEA及联合化疗对L615白血病细胞有抑制作用，对化疗后荷瘤小鼠造血系统具有一定的保护作用。
[关键词] 17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；抗肿瘤；环磷酰胺；造血功能
[中图分类号] R811.5[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）05（a）-0004-05
Effects of DHEA combined with Cyclophosphamide on leukemia L615 mice
WANG Xinyan1,2 WANG Yueying2 WU Hongying2 LU Lu2 ZHANG Junling2 MENG Aimin2 LI Deguan2▲
1.Cancer Hospital of Hangzhou City, Zhejiang Province, Hangzhou 310002, China; 2.Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeTianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Tianjin 300192, China
[Abstract] Objective To observe the therapeutic effects of 17a α-D-homo ethynyclestradiol-3-accetate (DHEA) combining with Cyclophosphamide(CTX) on the mice inoculated with leukemia L615 cells. Methods The mice inoculated with L615 were divided into control group, CTX group (treated with CTX), three DHEA groups (treated with low, middle and high doses DHEA), three combined groups (treated with low, middle, high doses DHEA and CTX). The mice were continuously delivered drugs for 9 days. The tumor inhibition rate, blood and bone marrow nucleated cell counts, spleen and thymus indexes were determined at 12 days. Results The tumors weight in the mice of three DHEA groups and three combined groups were all significantly lower than those in mice of control group, the tumor inhibitory rates were 45.40%, 67.94%, 50.48%, 70.48%, 69.21%, 75.87% and 72.06% respectively, the differences were statistically significant (P < 0.01). The tumors weight of middle DHEA dose group were lower than those of low DHEA dose group and high DHEA dose group (P < 0.05). The WBC counts of three DHEA groups [(15.87±3.32)×109, (17.92±1.79)×109, (18.55±
1.杭州市肿瘤医院，浙江杭州 310002；
2.中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所天津放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192
3.21)×109/L] and three combined groups [(16.72±2.67)×109, (18.98±2.34)×109, (19.65±2.79)×109/L] were significantly higher than those of control group [(13.32±2.56)×109/L], the differences were statistically significant (P < 0.01). The WBC counts of three DHEA groups and three combined groups were higher than those of CTX group [(10.56±1.83)×109/L], the differences were statistically significant (P < 0.01). The BMNCs of three DHEA groups [(8.28±2.12)×106, (9.93±1.36)×106, (8.22±1.91)×106/femur] and three combined groups [(7.55±1.13)×106, (8.67±2.21)×106, (7.96±1.46)×106/femur] were significantly higher than those of control gruop [(6.34±1.21)×106/femur], the differences were statistically significant (P < 0.05). The BMNCs of middle DHEA group was higher than that of CTX group [(7.92±0.89)×106/femur], the difference was statistically significant (P < 0.01). The thymus and spleen index of three DHEA groups and three combined groups were higher than those of control group, the differences were statistically significant (P < 0.01). Conclusion DHEA alone or DHEA combining with CTX shows inhibitory effects on the L615 tumor of mice and protective effects on the hematopoiesis of mice received chemotherapy.
[Key words] 17a α-D-home ethynyclestradiol-3-accetate; Tumor inhibitory effects; Cyclophosphamide; Hematopoietic function
恶性肿瘤的治疗主要包括手术及放化疗，而放、化疗主要副作用是抑制免疫及造血功能，17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯（DHEA）是一种新型辐射防护剂，本研究前期试验结果显示,对小鼠的肝癌、食管癌、黑色素瘤、肺癌[1-4]等均有明显的抑制作用。本实验按照国家一类新药报批要求[5]，通过建立L615白血病小鼠模型，探讨单独使用DHEA及DHEA联合环磷酰胺（CTX）药物对L615白血病是否具有抑瘤增效作用，为其用于治疗肿瘤的研究提供实验依据。
1材料与方法
1.1 动物和细胞系
中国医学科学院放射所培育的IRM-2近交系小鼠，体重为20～22 g，雌雄各半，合格证号：SCXK（津）2005-0001，SPF级动物实验室饲养，饲料为清洁级全价鼠料，由北京科奥协力饲料有限公司提供。L 615白血病瘤株由中国医学科学院血研所提供。
1.2 试剂和仪器
CTX为上海华联制药有限公司产品,DHEA是中国医学科学院放射所合成的雌激素类辐射防护剂，白色粉末，无味。sysmex poch-100i全自动血液分析仪（日本），电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.3 L615荷瘤小鼠模型的建立
L615细胞生长至亚融合状态时收集细胞，用生理盐水调整细胞数约为5×107/mL，取0.2 mL接种于每只小鼠右侧腋窝下，计为实验第1天。
1.4 分组及给药
实验第3天，将荷瘤鼠随机分为对照组、CTX（25 mg/kg）组、DHEA低剂量（5 mg/kg）、中剂量（7.5 mg/kg）、高剂量（10 mg/kg）组，DHEA低、中、高剂量联合CTX组，每组各10只。DHEA组及DHEA联合CTX组腹腔注射DHEA,给药剂量0.2 mL/只，1次/d，连续9 d，对照组给予同体积茶油，DHEA联合CTX组及CTX组腹腔注射CTX，给药剂量0.2 mL/只，隔日1次，共4次。
1.5 外周血细胞计数
实验第l2天，小鼠眼球摘除采血，全自动血液分析仪计数血细胞数。处死小鼠取瘤体称重，计算抑瘤率，抑瘤率=[1－（治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）]×100％。取一侧股骨，用白细胞稀释液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞制成悬液，全自动血液分析仪计数骨髓有核细胞数。取胸腺、脾脏称重，计算胸腺和脾重指数。
1.6 生命延长率实验
取L615细胞悬液（细胞数约为5×107/mL）接种于小鼠腹腔，0.1 mL/只，实验第3天，将荷瘤鼠随机分为对照组、CTX（25 mg/kg）组、DHEA低剂量（5 mg/kg）、中剂量（7.5 mg/kg）、高剂量（10 mg/kg）组，DHEA低、中、高剂量联合CTX组，每组各10只。DHEA组及DHEA联合CTX组腹腔注射DHEA，给药剂量0.2 mL/只，1次/d，连续9 d，对照组给予同体积茶油，DHEA联合CTX组及CTX组腹腔注射CTX，给药剂量0.2 mL/只，隔日1次，共4次。观察生存期。生命延长率=[（治疗组平均生存天数/对照组平均生存天数）-1]×100％。
1.7统计学方法
采用统计软件Prism5.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；重复测量的计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DHEA及DHEA联合CTX对荷瘤小鼠L615的抑瘤作用
为了分析DHEA及DHEA联合CTX对L615的作用，本次实验首先观察了其对小鼠肿瘤大小的影响。结果显示，DHEA低、中、高剂量组、CTX组、DHEA联合CTX各组瘤重均低于对照组，差异均有高度统计学意义（t = 3.944、8.898、5.266、9.288、8.776、10.571、7.464，P < 0.01）。DHEA中、高剂量联合CTX组的瘤重低于CTX组，但与CTX组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。DHEA中剂量组瘤重均低于低剂量组及高剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。DHEA低剂量联合CTX组瘤重低于DHEA低剂量组，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；DHEA高剂量联合CTX组瘤重低于DHEA高剂量组，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。DHEA中剂量联合CTX组瘤重低于DHEA低剂量联合CTX组及DHEA高剂量联合CTX组，但差异无统计学意义（P > 0.05），结果显示DHEA低、中、高剂量组及DHEA联合CTX组，对L615肿瘤细胞均呈明显的抑制作用。而计算抑瘤率表明DHEA中剂量联合CTX组对L615肿瘤细胞最具抑制作用。见表1。
表1 DHEA及DHEA联合CTX对荷瘤鼠L615肿瘤的抑制率
注：与对照组比较，*P ＜ 0.01；与CTX组比较，▲P ＜ 0.05；与DHEA低剂量组比较，△P ＜ 0.05；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；CTX：环磷酰胺；“-”代表无数据
2.2 DHEA、DHEA联合CTX对荷瘤小鼠L 615白细胞及骨髓有核细胞的影响
造血免疫系统在肿瘤发生发展过程中占据重要地位，本次实验观察了DHEA、CTX及DHEA联合CTX对荷瘤小鼠外周血及单侧股骨有核细胞数的影响。DHEA低、中、高剂量组白细胞数及DHEA联合CTX各组的白细胞数均高于对照组，其中DHEA中剂量组及高剂量组与对照组比较差异有高度统计学意义（t = 4.656、5.207，P < 0.01）。DHEA高剂量组及中剂量组的白细胞数要高于低剂量组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。DHEA低、中、高剂量联合CTX组的白细胞数与对照组比较差异有高度统计学意义（t = 2.906、5.161，5.286，P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组的白细胞数均高于CTX组，差异有高度统计学意义（t = 4.429、9.092、9.631，P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量联合CTX组的白细胞数均高于CTX组，差异有高度统计学意义（t = 6.017、8.964、9.043，P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组的骨髓有核细胞数均高于对照组，差异有统计学意义（t = 2.513、6.236、2.629，P < 0.05、P < 0.01、P < 0.05）。CTX组的骨髓有核细胞数与对照组比较差异有统计学意义（t = 3.327，P < 0.01）。DHEA联合CTX低、中、高剂量组的骨髓有核细胞数均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义（t = 2.311，P < 0.05；2.924，P < 0.05；2.701，P < 0.05、P < 0.01）。DHEA中剂量组的骨髓有核细胞与CTX组比较差异有高度统计学意义（t = 3.911， P < 0.01）。DHEA中剂量组的骨髓有核细胞高于DHEA低剂量联合CTX组及DHEA高剂量联合CTX组，差异有高度统计学意义（t = 4.256、3.122，P < 0.01），这些结果提示DHEA及DHEA联合CTX对荷瘤小鼠的造血免疫系统有一定保护作用。
表2 DHEA及联合CTX对荷瘤鼠 L615白细胞
及骨髓有核细胞造血的影响（x±s）
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与CTX组比较，#P < 0.01；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；CTX：环磷酰胺
2.3 DHEA、DHEA联合CTX对荷瘤小鼠L615脏器指数的影响
胸腺和脾脏是重要的免疫器官，本次实验观察了DHEA、DHEA联合CTX及CTX对这两个脏器的影响。DHEA低、中、高剂量组及DHEA联合CTX各组的胸腺指数均高于对照组，其中DHEA低、中剂量组与对照组比较差异有高度统计学意义（t = 12.280、5.993，P < 0.01）。CTX组与对照组比较差异有高度统计学意义（t = 4.715，P < 0.01）。DHEA低、中、高剂量组联合CTX组与对照组比较差异有统计学意义（t = 3.253、7.513、2.578，P < 0.01、P < 0.05），DHEA中剂量组和DHEA中剂量联合CTX组与CTX组比较差异有统计学意义（t = 3.284、3.019，P < 0.01）；DHEA低、中、高剂量组与对照组比较差异有统计学意义（t = 5.205、5.428、3.389，P < 0.01），DHEA低、中、高剂量联合CTX组的脾重指数均高于对照组，差异有统计学意义（t = 8.255、17.517、10.708，P < 0.01）。见表3。
2.4 DHEA及DHEA联合CTX对荷瘤小鼠的平均存活时间及生命延长率的影响
肿瘤患者生存率是治疗是否有效的重要指标，本次实验观察了DHEA、DHEA联合CTX及CTX对荷瘤小鼠存活时间的影响。DHEA各组及DHEA联合CTX各组荷瘤小鼠平均存活天数均高于对照组，其中DHEA低、中、高剂量联合CTX组与对照组比较差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA联合CTX各组荷瘤小鼠的平均存活天数高于CTX组，其中DHEA中剂量联合CTX组与CTX组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。表明DHEA及DHEA联合CTX给药有助于提高荷瘤小鼠的平均存活时间，抑制L615肿瘤的发生发展。见表4。
表4 DHEA及DHE联合CTX各组荷瘤小鼠的平均存活时间
及生命延长率
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与CTX组比较，#P < 0.05；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；CTX：环磷酰胺；“-”代表无数据
3 讨论
化疗已成为晚期恶性肿瘤患者最重要的治疗方法之一，但是化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤机体的正常细胞，使原本免疫功能低下的肿瘤患者的免疫力进一步降低，肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能密切相关[6-7]，所以降低化疗药物的毒副作用，提高肿瘤患者的免疫功能，充分发挥化疗药物的治疗作用，日益成为国内外专家学者研究的方向[8-10]。DHEA是中国医学科学院北京协和医学院放射所研制的炔雌醇的衍生物，经过研究证实，其对由于辐射引起的造血组织损伤具有预防和治疗的作用。本次实验结果证明，DHEA明显抑制荷瘤小鼠L615白血病的生长，肿瘤生长速度明显减漫，瘤重明显减轻，DHEA低、中、高剂量组抑瘤率分别为45.40％、67.94％、50.48％，与对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。DHEA中剂量组瘤重均低于低剂量组及高剂量组，与低、高两组比较差异有统计学意义（P < 0.05），说明中剂量抑制肿瘤效果好于低剂量和高剂量。环磷酰胺作为常用的化疗药物，本实验中作为化疗治疗药物[11-12]。当DHEA（低、中、高剂量）与CTX联合应用时，抑瘤率分别为69.21％、75.87％、72.06％，与对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。表明具有良好的协同抗瘤效果，DHEA中剂量联合CTX组的抑瘤率（75.87％）高于CTX组（70.48％）和DHEA中剂量组（67.94％），进一步说明中等剂量DHEA具有良好疗效。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺、睥脏质量在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱，而化疗药物的应用可加重机体的免疫抑制， 因此提高化疗后的免疫功能非常重要[13]。脾脏和胸腺在化疗药物作用下，其组织结构较快地发生严重损伤，表现为明显萎缩，从而抑制了机体的免疫和抗病能力。实验结果证明，DHEA单独给药及联合化疗均能增加胸腺和脾脏的重量。同时均能增加癌荷瘤小鼠的白细胞和骨髓有核细胞的数量。DHEA低、中、高剂量组白细胞数及DHEA联合CTX各组的白细胞数均高于对照组，其中DHEA中剂量组、高剂量组及DHEA联合CTX各组与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.01），DHEA高剂量组及中剂量组的白细胞数要高于低剂量组，但差异无统计学意义。DHEA中剂量组的骨髓有核细胞高于CTX组及DHEA低剂量联合CTX组、DHEA高剂量联合CTX组，差异有统计学意义（P < 0.01），这些结果提示单独给予DHEA及DHEA联合CTX对荷瘤小鼠的造血免疫系统有一定保护作用。
DHEA联合CTX化疗治疗荷瘤小鼠后，能延长荷瘤小鼠的存活时间，生存期比单纯的CTX化疗生存率有所提高。表明DHEA及联合化疗对L615移植小鼠肿瘤具有显著的协同抗瘤效果，改善化疗后荷瘤小鼠的造血功能及降低免疫抑制作用，其具体作用机制有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2014-01-14本文编辑：苏畅）
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（编号81102873）；天津市自然科学基金资助项目（编号12JCQNJC09100）。
[作者简介] 王忻妍（1979.11-），女，硕士研究生；研究方向：肿瘤治疗。
▲通讯作者