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摘要 为明确反枝苋抗性种群对氟磺胺草醚的抗性机制，分别测定了氟磺胺草醚对反枝苋抗性和敏感种群体内原卟啉原氧化酶（PPO）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性的影响。结果表明：氟磺胺草醚处理后，抗性和敏感反枝苋种群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复，而敏感种群则不能恢复;施用氟磺胺草醚后，抗性和敏感反枝苋种群GSTs和SOD活性变化无明显差异，抗性和敏感反枝苋种群POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复，而敏感种群则不能恢复。研究表明，反枝苋抗性种群体内PPO对氟磺胺草醚敏感性降低是其产生抗药性的原因之一，反枝苋POD和CAT对活性氧的抵御能力差异也可能与反枝苋对氟磺胺草醚的抗性有关。
关键词 反枝苋; 氟磺胺草醚; 抗药性机制
中图分类号： S 481.4 文献标识码： A DOI： 10.16688/j.zwbh.2018406
Abstract To reveal the resistance mechanism of Amaranthus retroflexus L. to fomesafen， the enzyme assays of PPO， GSTs， POD， SOD， and CAT in both resistant （R） and susceptible （S） populations of A. retroflexus were performed. The results showed that the treatment of fomesafen inhibited the PPO activity in both R and S populations， and the PPO activity of R population could recover while that of the S population could not. After treatment with fomesafen， the activity changes of GSTs and SOD in both the R and S populations showed no obvious difference， while the POD and CAT activity was inhibited in both the R and S populations， and the POD and CAT activity in the R population could recover， while that of the S population could not. The results suggested that reduced sensitivity to PPO was one of the resistance mechanisms of A. retroflexus to fomesafen and the differences in the POD and CAT resistance to reactive oxygen species might also be related to the resistance of A. retroflexus to fomesafen.
Key words Amaranthus retroflexus; fomesafen; mechanism of resistance
根据国际抗除草剂杂草调查数据统计，截至2018年9月13日，全球已有255种（148种双子叶，107种单子叶）杂草的495个生物型，对70个国家的92种作物田的26种已知作用机制中的23种，共计163种除草剂产生了抗药性，几乎涵盖各类重要的除草剂[1-2]。抗性杂草已成为杂草治理和农业生产的严重威胁，由其引发的严重经济和安全问题备受全球关注。
反枝苋Amaranthus retroflexus L.，别名西风谷、野米谷等，是我国农田、果园常见的一年生阔叶杂草[3-4]。目前防治该类杂草的主要药剂是二苯醚类（diphenyl ether）除草剂，该类除草剂属于原卟啉原氧化酶（PPO）抑制剂，具有除草效果好，杀草谱广，选择性强等特点。然而，由于其连年大量使用，已导致多种杂草对其产生了抗性。截至2018年9月13日，在7个国家已有13种杂草对PPO抑制剂产生了抗性[1]。
氟磺胺草醚（fomesafen）是二苯醚类除草劑的主要品种之一，在我国大豆田应用十分广泛 [5-6]。但近年来，由于氟磺胺草醚的连年过量使用，防除反枝苋的效果开始下降，有些地区用药3次也难以达到理想的防除效果。目前，有关杂草对除草剂抗性机制的研究主要集中在以下2个方面：1）杂草对除草剂靶标位点的敏感性发生改变;2）杂草代谢解毒能力增强。滕春红等研究发现，黑龙江省黑河市嫩江县采集点的反枝苋对氟磺胺草醚产生了高水平抗性，温室盆栽法测得其抗性倍数为101.74[7]。Wuerffel等采用等位基因特异性PCR扩增了94个糙果苋A.tuberculatus种群的PPO基因，发现抗乳氟禾草灵生物型的PPX2L基因的第210位甘氨酸缺失，表明该位点缺失与糙果苋抗性生物体内PPO敏感性降低相关[8]。
为了进一步阐明反枝苋对氟磺胺草醚产生抗性的机制，为抗性杂草研究和治理提供理论依据，测定了氟磺胺草醚对抗性和敏感种群反枝苋体内原卟啉原氧化酶（PPO）活性、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物
反枝苋抗性种群（R）于2014年9-10月采自黑龙江省嫩江县前进镇东升村大豆田，温室盆栽法测得抗性生物型对氟磺胺草醚的抗药性倍数为101.74[7];反枝苋敏感种群（S）于2014年9-10月采自黑龙江省牡丹江市东宁县大肚川镇非耕地，从未施用过除草剂。反枝苋经鉴定后晾干，装入牛皮纸袋，保存在4℃冰箱待用。
1.1.2 供试除草剂
250 g/L氟磺胺草醚水剂，大连松辽化工有限公司生产。
1.1.3 供试试剂
甲硫氨酸 （Met）、四氮唑蓝（NBT）、乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）、核黄素 （FD）、磷酸缓冲液、1%愈创木酚、30%H2O2溶液、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、磷酸、无水乙醇、Tris-HCl缓冲液、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、NaOH、KNO3、还原型谷胱甘肽、1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）。
原卟啉原氧化酶（PPO）ELISA酶联免疫分析检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。
1.1.4 供试仪器设备
双光束紫外可见分光光度计（TU-1901）、酶标仪（352型）高速冷冻离心机ST 16R、离心管、移液枪、石英比色皿、研钵。
1.2 方法
采用盆栽法。在每个营养钵中均匀播种20粒反枝苋种子，上面盖2 cm细土并镇压。出苗后间苗，每盆保留10株。3～5叶期进行茎叶处理，250 g/L氟磺胺草醚水剂的有效用药量为150 g/hm2。试验采用随机区组设计，每处理4次重复，设置清水作为对照，试验重复2次。分别于施药前、施药后1、3、5、7和14 d剪取不同种群反枝苋叶片，称重后作为试验样品。样品于-20℃保存，冰浴磨样，分别测定PPO活性、GSTs活性、SOD、POD及CAT活性。
1.2.1 PPO活性的测定
PPO活性测定按照酶活性检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司）步骤进行，利用酶标仪检测。
1.2.2 谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性的测定
参照Pamela等、陶波等[9-10]的方法并改进，取0.2 g反枝苋叶片制成待测酶液。取0.5 mL 3.0 mol/L谷胱甘肽溶液，加入2.3 mL 0.1 mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液，加入50 μL上述待测酶液，最后加入20 mmoL/L的CDNB 0.15 mL，并设蒸馏水对照调零。在340 nm波长处检测其吸光值在2 min內的变化，并记录OD值。以1 mg/L蛋白10 min催化反应，吸光值变化0.001为一个酶活性单位（1U），以1 mg/L可溶性蛋白的含量表示为GSTs酶活性。
1.2.3 SOD、POD和CAT活性测定
分别取0.2 g反枝苋叶片制成待测酶液。参照并改进Giannoplitis等[11]的方法测定SOD活性，在560 nm波长下测定各管的吸光度，以抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原50%为一个酶活性单位（U）表示酶活力;参照并改进郝再彬等[12]的方法测定POD活性，在470 nm波长下比色，每隔1 min记录一次，记录3 min内的变化值，以吸光度变化0.01为一个酶活性单位（U）表示酶活力;参照并改进刘亚光等[13]的方法测定CAT活性，在240 nm下比色，每隔1 min记数一次，共读数3次，以每分钟吸光度的变化值表示酶活力的大小。
1.2.4 数据处理
数据采用DPS 7.05软件进行统计分析。用Excel 2010做折线图，以标准差定义误差线。
2 结果与分析
2.1 氟磺胺草醚对不同反枝苋种群PPO活性的影响
氟磺胺草醚对不同反枝苋种群PPO活性的影响如图1所示。施药前R种群的PPO活性是S种群的1.42倍。施用氟磺胺草醚后，R种群和S种群的PPO活性均随着处理时间的增加呈先降低后升高再降低的趋势，R种群在处理3 d到14 d一直高于或接近对照水平，S种群的PPO活性一直低于对照水平。施药后14 d，R种群和S种群的PPO活性分别比对照组降低了6.41%和47.44%。
2.2 氟磺胺草醚对不同反枝苋种群GSTs活力的影响
氟磺胺草醚对不同反枝苋种群GSTs活性的影响如图2所示。施药前R种群的GSTs活性是S种群的1.92倍。施用氟磺胺草醚后，R种群和S种群GSTs活性随着施药天数的增加呈先降低后升高再降低的趋势。施药后14 d，R种群和S种群GSTs活性分别比对照组降低了9.51%和11.54%。
2.3 氟磺胺草醚对不同反枝苋种群SOD活性的影响
氟磺胺草醚对不同反枝苋种群SOD活性的影响如图3所示。施药前R种群SOD活性是S种群的1.45倍。施用氟磺胺草醚后，R种群和S种群SOD活性随着施药天数的增加呈先降低后升高再降低的趋势。R种群和S种群均可以恢复到接近对照水平。施药后14 d，R种群和S种群SOD活性分别比对照组降低了2.13%和3.94%。
2.4 氟磺胺草醚对不同反枝苋种群POD活性的影响
氟磺胺草醚对不同反枝苋种群POD活性的影响如图4所示。施药前R种群的POD活性是S种群的1.55倍。施用氟磺胺草醚后，R种群和S种群的POD活性均随着施药天数的增加呈先降低后升高再降低的趋势。施药后14 d，R种群的POD活性比对照组增加了8.02%，S种群的POD活性比对照组减少了14.63%。
上述结果表明，在受到氟磺胺草醚胁迫后，R种群POD活性能逐渐恢复并增强来防御活性氧对植物组织内细胞膜的伤害，而S种群则不能恢复。
2.5 氟磺胺草醚对不同反枝苋种群CAT活性的影响
氟磺胺草醚对不同反枝苋种群CAT活性的影响如图5所示。施药前R种群CAT活性是S种群的1.57倍。施用氟磺胺草醚后，R种群和S种群CAT活性随着施药天数的增加呈先降低后升高再降低的趋势。施药后14 d，R种群和S种群的CAT活性分别比对照组降低了3.21%和13.83%。
上述结果表明，在受到氟磺胺草醚胁迫后，R种群和S种群的CAT活性均受到抑制，R种群CAT活性能逐渐恢复来防御活性氧对植物组织内细胞膜的伤害，而S种群则不能恢复。
3 结论与讨论
靶标酶活性、代谢酶GSTs活性以及保护酶（SOD、POD、CAT）活性是衡量除草剂对杂草胁迫情况的重要指标[14-15]。氟磺胺草醚属于二苯醚类除草剂，该类除草剂的作用靶标是原卟啉原氧化酶（PPO），此类除草剂主要通过抑制叶绿素生物合成途径中合成四吡咯所必需的原卟啉原氧化酶来防治杂草[16]。氟磺胺草醚处理后，抗性和敏感反枝苋种群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复，而敏感种群则不能恢复。说明氟磺胺草醚对反枝苋抗性种群PPO活性的抑制作用不明显，而对敏感种群PPO活性的抑制作用较大。
GSTs在杂草对除草剂的抗药性中起着非常重要的作用[17]。王笑等认为GSTs的类型和活性的大小可作为植物抗除草剂能力的一个重要指标[18-20]。氟磺胺草醚胁迫后，R种群和S种群GSTs活性均受到抑制，然后通过逐渐提高活性来减少这种抑制作用，但不能恢复到对照水平。R、S种群GSTs活性变化趋势基本一致，不存在明显差异。说明反枝苋体内GSTs对进入到叶片组织中的氟磺胺草醚有一定的代谢能力，从而部分地减弱氟磺胺草醚对反枝苋组织的伤害。
植物体内存在着许多种抗氧化酶，SOD、POD及CAT在清除植物体内活性氧对植物细胞质膜以及细胞膜等膜系统的伤害方面起着重要作用[21]。许多研究表明，在抗性杂草种群中代谢解毒酶SOD、POD及CAT活性增强[13，22-23]。氟磺胺草醚胁迫后，R、S种群的SOD活性均受到抑制，而后SOD活性逐渐恢复来防御活性氧对植物组织内细胞膜的伤害，抗性和敏感反枝苋种群SOD活性变化无明显差异，R、S种群的POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复，而敏感种群则不能恢复。这与刘亚光等研究稗草种群对莠去津、乙草胺和硝磺草酮的抗性机理及马红等研究野黍对烟嘧磺隆的抗性机理的结果相似[13，23]。
細胞色素酶系在除草剂的选择性和杂草抗药性方面也发挥着重要的作用[8]，而抗氟磺胺草醚反枝苋生物型体内P450 酶系活性的变化规律还有待于进一步研究。反枝苋对氟磺胺草醚抗性的分子机制也有待进一步研究。
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（责任编辑： 田 喆）