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摘要：从雪莲果叶片的病斑上分离得到一种病原真菌，根据病害症状特点、病菌形态特征和培养性状等进行鉴定，确定其为链格孢属（Alternaria spp.）真菌。设置不同的培养基、pH值、温度、湿度及光照对叶腐病菌进行生物学特性研究，结果表明，该菌最适生长培养基为PDA培养基，最佳pH值为7.0，最适生长温度为 26 ℃，最适生长湿度为65%，光照对其影响不大。
关键词：雪莲果；叶腐病；链格孢；鉴定；生物学特性
中图分类号： S432.4+4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0121-03
雪莲果，属菊科葵花属植物，含有酚酸、黄酮、酯类、挥发油、多糖等成分，清肝解毒、清理肠胃、排毒通便、养颜美容，并有降血糖、降血脂、抑菌、促进铁钙吸收等药理作用，特别适合糖尿病人和减肥者食用[1-2]。近年来通过多种途径进入我国，目前已在云南、福建、贵州等地引种栽培成功[3-4]。然而，雪莲果自传入我国这十余年来，其相关理论和技术研究较少，尤其对种植过程中病虫害的发生情况及其防治措施未见深入研究及报道，这显然与近年来其发展趋势是相矛盾的。同时，近年来由于雪莲果在四川攀西地区的大面积连年种植以及气候变化等原因，雪莲果种植的各个时期叶腐病、镰刀叶斑病、褐斑病、紫斑病等叶部病害发生较为严重，且有逐年加重的趋势，对其生产带来了较大的危害，但国内外学者对雪莲果叶部病害尤其是叶腐病进行系统研究的资料甚少，这显然已不适应当前雪莲果产业的发展要求[5]。由此可知，研究雪莲果叶腐病的发生、发展规律及防治措施对雪莲果产业的发展具有重大的理论和现实意义。鉴于此，本研究在攀西地区特定条件下，对雪莲果叶腐病进行了病原菌鉴定和生物学特性研究，为雪莲果种植及病害的防治提供一定的理论和实践依据。
1 材料与方法
1.1 病原菌的分离、纯化及鉴定
1.1.1 样本采集及病原菌分离
病害样本采集于西昌学院农业科学学院试验田（该试验田雪莲果种植的整个时期均未施用任何化学农药），对叶部（叶面、叶缘、叶尖）病害进行症状观察和记录并带回实验室供室内试验。参照《植病研究方法》中病原真菌的组织分离法[6]对叶片上的病原菌进行分离、纯化，并经单孢分离获得纯培养菌株。
1.1.2 病原菌形态特征观察与鉴定 将菌株移于PDA平板上，置于22 ℃的恒温培养箱中培养，逐日观察记录病原菌的培养性状。经过PDA培养纯化后，挑取所得的纯菌株制片，并在显微镜下观察病原菌孢子的形态特征。根据以上性状并查阅相关文献，初步判定病原菌的种类。
1.1.3 病原菌的科赫氏法则鉴定 用所得的菌株配成孢子悬浮液，采用刺伤和无伤接种法[7-8]，把孢子液涂于雪莲果的健康叶片上，以无菌水涂抹叶片保湿作对照，然后将接种的雪莲果叶片放入具有湿润无菌纸的培养皿中，置于22 ℃的恒温培养箱内保湿培养。每处理重复3次，观察和记录接种结果，比较其发病症状是否与初次分离时的症状一致，并对接种成功的病斑再次进行组织分离，确认致病菌株。
1.2 雪莲果叶腐病病原菌生物学特性研究
处理的设置分别如下：选择燕麦培养基、PDA、PSA、玉米培养基和牛肉膏蛋白胨培养基共5种不同培养基进行雪莲果叶腐病病原菌最佳培养基筛选试验，其最优结果作为其他试验所采用的培养基；病菌最适培养pH值试验分别设置pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6个pH值梯度，筛选得到的最佳pH值作为后续试验的基础条件；病菌适宜培养温度试验设置18、20、22、24、26、28、30 ℃共7个温度梯度，所得出的最佳温度作为后续试验培养该菌的基本温度；病菌最佳培养湿度试验设置35%、50%、65%、75%、79.8%和88%共6个梯度；光照对菌落生长的影响试验设全黑暗、半光照（日光灯照射12 h光暗交替）和全光照3个处理。以上各试验每处理均做3次重复。
将活化的菌种用打孔器打成直径为0.4 cm的菌饼，分别接种后放到不同试验条件下培养，采用“十”字交叉法逐日测量菌落直径并观察生长情况。
将各项试验记录数据分别录入相应的数据文件，用Microsoft Excel和SigmaPlot 10.0软件计算各处理的平均值和标准差，并进行统计分析比较和作图。
2 结果与分析
2.1 病原菌鉴定
2.1.1 病原菌症状描述
该病危害雪莲果叶片，初期病部为淡黄色圆形或不规则小点，无明显晕圈，后期病斑沿叶脉呈条形散射状扩大，继而连成一片，天气潮湿时叶片腐烂，其上产生大量黑褐色霉层（图1）。
2.1.2 病原菌的培养性状及形态特征
病原菌在PDA培养基上菌落呈绒毛状，不规则圆形，菌丝初期呈灰白色至灰褐色，后期菌落表面颜色有明显分层现象，菌落中间灰黑色，边缘灰白色；接种1～2 d内气生菌丝以垂直生长为主，菌落隆起高度可达1 cm，接种3 d后菌丝横向生长速度加快，接种 6 d 后菌丝成熟，其顶端出现黑色小粒点，开始产孢（图2）。菌丝直径0.82～2.87（平均1.63） μm，早期菌丝无隔，后期逐渐产生隔膜；无性孢子为分生孢子，孢子有隔，单生或串生呈球形、卵形至长圆形，大小在7.12～13.79（平均9.72） μm×1.98～7.54（平均4.57） μm范围内；节间产生小格孢，成不规则的灰黑色四边形，格孢大小为3.30～14.41（平均9.88） μm×1.83～8.22（平均494） μm（图3）。
2.1.3 科赫氏法则证病
把从发病部位分离获得的病原菌菌株回接到健康无病的雪莲果叶片上，刺伤接种的叶片5 d后开始发病，无伤接种的叶片10 d后开始发病。无论是刺伤接种还是无伤接种，其症状特点与自然发病叶片相同，清水对照不发病。从接种的病组织分离的病原菌与自然发病组织分离的病原菌形态一致。
根据病原菌症状特点、形态特征、培养性状及科赫氏证病结果，并参考相关文献，确定从该地区雪莲果叶片上分离得到的病原菌为链格孢属（Alternaria spp.）真菌。
2.2 雪莲果叶腐病病原菌生物学特性研究
2.2.1 不同培养基对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 经活化后的雪莲果叶腐病菌在5種培养基中均可正常生长，各菌落生长的平均直径大小不一（图4）。在PDA、PSA培养基中生长无显著性差异，它们与其他培养基上的菌落平均直径呈极显著差异（P<0.01），在玉米培养基中生长最慢。在5种培养基上菌株的直径大小依次为：PDA>PSA>燕麦>牛肉膏蛋白胨>玉米培养基。其中，菌株被培养96 h时菌落直径在PDA培养基中优先达到最大，达7.13 cm，且菌丝灰白、浓密，整齐度高。因此，PDA培养基是雪莲果叶腐病菌生长的最佳培养基，并且在接下来的pH值、温度、湿度和光照条件的试验中均采用该培养基作为该菌的基础培养基。
2.2.2 不同pH值对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 将经活化后的雪莲果叶腐病菌接种到不同pH值的PDA培养基上，菌株在pH值为4.0～9.0范围内均能生长。pH值为4.0～7.0范围内菌株的菌落平均直径随pH值增加而增加；pH值为 80～9.0 时，菌落平均直径随pH值升高而减小 （图5）。菌株在pH值为4.0时生长最慢，培养7 d时其菌落平均直径仅为2.8 cm；在pH值为7.0的培养基中生长良好，培养7 d时其平均菌落直径达到7.17 cm，与其他各处理间差异达到极显著水平（P<0.01）。因此，通过该试验可以得出雪莲果叶腐病菌的最适宜生长pH值为7.0。因此，在接下来的温度、湿度和光照条件的试验中均采用该pH值条件为其基本培养条件。
2.2.3 不同温度对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 图6表明，各种温度下菌落平均直径有明显的差异，温度是影响菌株生长的重要因子。菌株在18～30 ℃都能生长，但生长的适温范围是24～26 ℃，以26 ℃最佳，在此温度下培养的菌落生长最快且菌丝浓密整齐，培养7 d时平均菌落直径达到6.97 cm，与其他各处理间差异极显著（P<0.01）。当培养温度为18 ℃和30 ℃时菌丝生长受到抑制，培养7 d时其菌落平均直径最小，分别仅为2.77 cm和2.97 cm， 与其他处理呈极显著差异。以上结果说明，雪莲果叶腐病菌生长的最适温度为26 ℃，温度过高或过低均不利于该菌株生长。因此，在接下来的湿度和光照条件试验中均采用该温度条件为该菌的基本生长条件。
2.2.4 不同湿度对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 将在pH值为7.0的PDA培养基上以26 ℃恒温培养的雪莲果叶腐病菌在不同湿度条件下进行培养，菌株的生长情况如图7所示。该菌在供试湿度范围35%～88%内均可生长，在湿度为50%～75%时生长较快，以65%最佳，此条件下培养的菌落生长最快，培养7 d时其平均菌落直径高达7.10 cm，与其他湿度条件的处理差异极显著（P<0.01），而当湿度为88%和35%时菌丝生长受到抑制，其菌落直径最小。通过该试验可以得出雪莲果叶腐病菌的最适宜生长湿度为65%，并将其作为光照条件试验的湿度条件。
2.2.5 不同光照条件对雪莲果叶腐病菌菌丝生长的影响 将经活化后的雪莲果叶腐病菌菌丝块接种到pH值为7.0的PDA培养基上，在温度26 ℃、湿度为65%条件下置于不同光照环境中培养，该菌株均能够正常生长，在全光照、半光照、全黑暗的生长条件下菌落的生长直径之间没有显著性差异，不同的光照条件对雪莲果叶腐病菌的生长影响不大（图8）。
3 结论与讨论
通过对雪莲果叶腐病症状的观察、病原菌的分离培养以及病原菌的鉴定，确定雪莲果叶腐病病原菌为链格孢属（Alternari spp.）真菌。
病原菌生物学特性试验中分别研究了不同培养基、pH值、温度、湿度和光照条件对雪莲果叶腐病菌生长情况的影响，采用只允许一个变量发生变化，而其他量不变的单因素试验方法，通过分步骤试验，并进行单因素方差分析找出相应的显著性关系，最后依次找出最佳试验因子。结果表明，雪莲果叶腐病菌的最适生长培养基为PDA培养基，最佳pH值为7.0，最适生长温度为26 ℃，最适生长湿度为65%，光照对其影响不大。这些结果与王仕玉等对齿瓣石斛病原链格孢菌（Alternaria tenuis）和王春江等对小麦链格孢（Alternaria triticina）的生物学特性研究的结果[9-10]基本相近，仅在对pH值变化的反应方面存在一定的差异。这可能是由于菌株在不同的地域及寄主植物上产生不同的寄生适应性，而这些适应性导致其在某些生物学特性上可能显示出一定的差别。
本研究明确了雪莲果叶腐病的致病病原菌及该菌的主要生物学特性，为进一步研究该菌奠定了基础，对于有效控制该病提供了重要的参考价值。
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