摘 要 研究菜心小孢子不同發育时期的细胞学特征及其与花器官外部形态的相关性，为直接从花器官外部形态特征来判断小孢子发育时期提供依据。结果表明，菜心小孢子发育分为四分体时期、单核期和双核期，各时期特征明显。菜心小孢子发育时期与花蕾和花药外部形态特征密切相关，供试菜心材料中处在单核靠边期的花蕾纵径为3.05～ 3.39 mm，花萼长为3.25～3.46 mm，花瓣长为2.10～2.33 mm，瓣萼比为0.63～0.71，花药长为2.57～2.89 mm、瓣药比为0.77～0.85，适合作为不同材料花蕾最佳取样时期的鉴定指标。处在单核靠边期的花器官外观特征表现为花蕾饱满，萼片绿色并包被着花冠，花瓣和花药均为浅黄色，花药略长于花瓣。可见，依据花器官形态特征可判断菜心小孢子的发育时期及所对应的选蕾标准。
关键词 菜心;小孢子;发育时期;花器官;形态特征中图分类号 S634.5 文献标识码 A
Correlation of Microspore Development Period and Flower Morphological Characteristics of Chinese Flowering Cabbage
PANG Qiangqiang， LI Deming， ZHOU Man， ZHU Baibi， ZHAO Shuniu， CAI Xinglai*
Vegetable Research Institute， Hainan Provincial Academy of Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory for Vegetable and Biology / Hainan Provincial Engineering Research Center for Melon and Vegetable Breeding， Haikou， Hainan 571100， China
Abstract The cytological characteristics of microspores in Chinese flowering cabbage at different developmental periods were studied to reveal the relationship between microspore development and buds morphology， which would provide evidences for the culturing of anthers and microspores. The results showed that the microspore developed in tetrad， early- or mid-uninucleate， late-uninucleate and binucleate stages obviously. The microspore development showed correlativity with the morphological characteristics of buds and anthers. The buds 3.05–3.39 mm in height， the calyx 3.25–3.46 mm in length， the petal 2.10–2.33 mm in length， the ratio of flap to calyx 0.63–0.71， the anther 2.57–2.89 mm in length， and the ratio of flap 0.77–0.85 were discovered to contain microspores at the late uninucleate. These were suitable for the identification of optimal sampling period of flower buds in different materials. At the late uninucleate stage， it was necessary that the anthers should be covered by the sepal， the anthers slightly longer than petals， and the flower bud was full， the petals and anthers showed pale yellow. Therefore， we can judge the development stage of Chinese flowering cabbage microspore by morphological characteristics of flower organs so as to define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anthers culture.
Keywords Chinese flowering cabbage; microspore; developmental period; flowers organs; morphological characteristics
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.008
菜心（Brassica rapa syn. Campestris ssp. Chinensis var. Utilis Tsen et Lee）又名菜薹，为十字花科芸薹属一、二年生草本植物，由大白菜亚种和白菜亚种长期选择和栽培驯化而来，原产我国南部，是我国华南地区的特产[1]，生长周期短，在蔬菜周年供应尤其是淡季蔬菜供应上占有重要地位[2]。菜心品质脆嫩、风味独特，并伴有清热解毒、杀菌、降血脂的功能[3-4]， 因而具有“蔬品之冠”的美誉。菜心为异花授粉植物，杂种优势明显，但纯合非常困难，利用一代杂种培育优良的自交系亲本一般需6～8代，要对所选单株进行连续多代剥蕾自交纯化，相当费工费时，且长期自交会出现自交衰退现象[5-6]。应用游离小孢子培养技术获得单倍体进而加倍成后代完全纯合的双单倍体植株（DH植株），可在较短时间内使材料得以纯化，从而大幅度缩短育种年限，而游离小孢子培养体系的建立是关键所在[7-8]。尽管小孢子培养技术已经取得了较大进展，但在实际操作中，小孢子培养受基因型[9]、小孢子发育时期[10]、供体植株所处的生理状态[11]、预处理[12]、培养基[13]等多种因素的影响，其中选择适宜的小孢子发育时期是决定小孢子能否诱导成功的关键因子之一。就多数植物而言，单核靠边期的小孢子最容易形成小孢子胚[14-16]。通过细胞学观察可确定小孢子的发育时期，但此方法需检查每一个花药，既费时费力，且会对小孢子活力造成一定的损伤。前人在辣椒[17]、黃瓜[18]、萝卜[19]、青花菜[20]和甘蓝[21]等多种植物上的研究结果表明，小孢子发育时期与花蕾外部形态，如花蕾纵径、花蕾横径、花药长、花药宽、花瓣长与花药长比值等密切相关，但不同品种和变种以及不同的栽培条件，其形态指标有所不同。虽然菜心在花药和小孢子培养方面已取得了很大进展，但是目前还存在着许多问题，导致出胚率和成苗率不高[22-23]。为此，本研究拟通过观察菜心小孢子各发育时期的细胞学特点，来探讨其与花器官外部形态的相关性，以便能根据花器官形态来确定小孢子发育时期，为进一步开展菜心小孢子培养奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以海南省农业科学院蔬菜研究所叶菜组提供的5个菜心品种为供试材料，分别为C01（油青菜心，早熟）、C02（四-九月菜心，晚熟）、C03（尖叶菜心，中熟）、C04（油绿粗薹菜心，早熟）、C05（尖叶70 d，晚熟）。2018年2月下旬在海南省农业科学院永发试验基地大棚内进行育苗，待幼苗长至5片真叶时定植于试验田，常规栽培管理直至抽薹开花。于晴天上午8：00左右采摘健康且长势较好的植株上的花蕾，取样时主花序上的花蕾优先，其次为第一、第二分枝上的花蕾。
1.2 方法
1.2.1 花蕾外部形态观察 采用数显游标卡尺测量菜心花蕾横径、花蕾纵径、花萼长和花瓣长并记录其形态特征，再将花萼、花瓣去除，取出花药切除花丝后，分别测量花药长度和花药宽度，记录花药颜色。每个发育时期观察并测量20个花蕾，重复3次。
1.2.2 小孢子不同发育阶段的细胞学观察 将各材料不同长度的花蕾（图1）置于卡诺氏固定液（冰醋酸∶95%酒精为1∶3）中固定24 h后，转移到70%酒精中，于0～4 ℃冰箱中保存。制片时，用镊子将花药从固定的花蕾中取出置于载玻片上，并轻轻挤出花粉，用DAPI 荧光染液染色、压片，制成临时制片，在荧光显微镜下观察细胞形态结构，确定其所处的发育时期，每次观察重复3次。
1.3 数据处理
数据初处理采用Excel 2007软件，差异显著性分析采用Duncan法。
2 结果与分析
2.1 菜心小孢子各发育阶段的细胞学特征
菜心不同发育时期花蕾的显微观察结果见图2。四分体时期，小孢子母细胞经过减数分裂后，形成由胼胝质包围的4个细胞，经染色后有4个细胞核出现，此时小孢子的外部形态呈现为明显的四裂状（图2A）;随后，酶催化四分体胼胝质壁水解，释放出的小孢子很快由不规则的外形轮廓变成圆形或近圆形，整个细胞体积较小，细胞核只有1个且处于细胞正中央，即单核中期（图2B）;之后，小孢子体积逐渐增大，绒毡层细胞解体并为小孢子提供充足营养，中央大液泡开始形成，细胞核从中心被挤压到靠近细胞壁，此时外形可见3 条较为明显的萌发沟，形成花粉外壁，即为单核靠边期（图2C）;最后，单核花粉细胞继续发育获得充实后进行第1次有丝分裂，由于是不均等分裂，因此形成1个体积较大靠近液泡的营养细胞和1个体积较小贴近细胞壁的生殖细胞，2个核形状均为圆球形（图2D）;花粉粒再膨大，最终发育成外壁成熟花粉粒。
2.2 菜心小孢子发育时期与花蕾形态特征的相关性
由表1可知，菜心小孢子发育时期与花蕾外部形态特征关系密切。同一菜心品种花蕾的各项形态指标，如花蕾纵径、花蕾横径、花萼长、花瓣长均随小孢子发育逐渐成熟呈显著或极显著增长的趋势。处于同一发育时期的花蕾各项形态指标在不同菜心品种间也存在差异。四分体时期的小孢子花蕾纵径为1.90～2.21 mm，花蕾横径为1.47～1.72 mm，花萼长为1.77～2.32 mm，花瓣长为0.63～0.76 mm，瓣萼比為0.33～0.41;花蕾纵径为2.46～2.68 mm，花蕾横径为1.69～1.89 mm，花萼长为2.44～2.88 mm，花瓣长为1.26～1.46 mm，瓣萼比为0.44～0.58，此时的小孢子处于单核早中期;当花蕾纵径为3.05～3.39 mm，花蕾横径为1.87～2.22 mm，花萼长为3.25～3.46 mm，花瓣长为2.10～2.35 mm，瓣萼比为0.63～0.71时，小孢子处于单核靠边期;双核期时花蕾的纵径为3.62～3.88 mm，花蕾横径为2.31～2.49 mm，花萼长为3.75～4.21 mm，花瓣长为3.17～3.70 mm，瓣萼比为0.84～0.92。
2.3 菜心小孢子发育时期与花药形态特征的相关性
由表2可知，同一基因型不同发育时期的菜心小孢子，其花药长、花药宽、瓣药比均存在显著或极显著差异;不同基因型同一发育时期花药形态指标也存在差异。其中四分体时期的花药长为1.51～1.82 mm，花药宽为0.52～0.63 mm，瓣药比为0.41～0.44;单核早中期的花药长为2.08～ 2.46 mm，花药宽为0.61～0.83 mm，瓣药比为0.51～0.68;单核靠边期花药长为2.57～2.89 mm，花药宽为0.82～1.01 mm，瓣药比为0.77～0.85;双核期的花药长为3.04～3.48 mm，花药宽为0.97～1.07 mm，瓣药比为1.00～1.22。
2.4 菜心小孢子发育时期与花蕾和花药外部形态变化的关系
由表3可知，随着小孢子发育时期的变化，不同基因型菜心的花蕾和花药外部形态也发生变化。适宜取材的单核靠边期的花蕾膨大较明显，花冠被萼片紧密包裹，花药较花瓣略长，花瓣和花药均为浅黄色。
3 讨论
植物小孢子发育可分为四分体时期、小孢子时期和成熟花粉粒时期，其中小孢子时期又包括单核早期、单核中期、单核靠边期和双核期。对于小孢子培养而言，并非任何发育时期的小孢子都适合。花蕾发育时期过早，小孢子尚未形成，此时受外界环境影响较大，几乎不能培养成胚[24];选取发育过晚的小孢子由于其因为失去脱分化能力，导致小孢子发育进程中断[25]。由此可见，小孢子发育时期对于小孢子培养成功与否起着决定性的作用。不同作物的小孢子最适培养时期不同，同一作物不同研究者得到的结果也有不同。Takahata等[26]在研究甘蓝时发现，甘蓝小孢子培养的最佳时期是单核靠边期至双核期。詹艳等[16]研究发现，单核靠边期是进行黄瓜游离小孢子培养的最佳时期，谢淼等[27]研究发现，处于单核中后期的黄瓜小孢子易于诱导出胚。袁素霞等[28]选取单核靠边期的结球甘蓝和青花菜花蕾进行游离小孢子培养，成功获得了约7000份小孢子再生植株。
本研究发现菜心小孢子发育过程不仅可划分为不同阶段，而且小孢子发育阶段与花器官各形态指标关系密切，因此可以根据花蕾形态、大小和花药发育情况来判断菜心小孢子的发育时期。在十字花科蔬菜上的研究表明，处于单核靠边期的小孢子易于诱导出胚状体[29-31]。通过观察5份菜心材料小孢子发育不同时期的花蕾和花药形态特征发现，不同菜心材料的小孢子处于单核靠边期的花蕾表现为花蕾饱满，萼片绿色并包被着花冠，花瓣和花药均为浅黄色，花药略长于花瓣，即花蕾纵径为3.05～3.39 mm，横径为1.97～ 2.22 mm，花萼长为3.25～3.46 mm，花瓣长为2.10～2.33 mm，瓣萼比为0.63～0.71，花药长为2.57～2.89 mm，花药宽为0.84～1.01 mm，瓣药比为0.77～0.85，此时就单个品种来说，这些指标均可作为确定小孢子发育适期花器官特征的参考。通过比较不同菜心材料花器官在单核靠边期的各项指标发现，花蕾横径和花药宽在不同基因型之间差异均较大，不易找到统一标准来确定最适花蕾大小，如C02单核靠边期的花蕾横径为1.87 mm，与C04单核早中期的1.89 mm接近。对于所有供试材料来说，单核靠边期的花蕾纵径、花萼长、花瓣长、瓣萼比、花药长和瓣药比与其他发育时期的同类指标相比不存在尺度上的重叠，因此它们更适合作为不同材料最适取样时期的鉴定指标，这与前人在菜心上的报道也较为类似。如朱允华[32]在菜心花药和花粉培养中发现，当花瓣达到花药长度的1/2～4/5、花药浅黄色、花蕾长为2.5～3.5 mm时，大多数的小孢子处于单核靠边期。吴艺飞等[33]用瓣萼比在0.626～0.834的花蕾成功进行了红菜薹小孢子培养。比较而言，前人在菜心等作物的小孢子培养研究中不曾采用瓣萼比这一指标，本文丰富了菜心小孢子培养的研究结果。在实际应用中，如果菜心小孢子最佳培养时期以单核靠边期为准，则可依据本研究结果来判断，以此实现在田间直接取材而不需要镜检，这对菜心小孢子培养具有重要意义。然而在进行菜心小孢子培养时，除上述影响因素外，还要考虑供体植株的基因型、生长环境、培养基、预处理等因素对培养效率的影响。
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