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摘 要：目的 探讨细胞DNA定量分析在不明原因胸水诊断中的应用价值。方法 收集本院2015年9月～2016年3月122例胸腔积液患者抽取胸水，标本制片后分别经巴氏染色行脱落细胞学检查，Feulgen染色后行细胞DNA定量分析。结果 122例胸腔积液中有56例恶性胸腔积液，66例良性胸腔积液。细胞学检测恶性胸水敏感度为82.14%，特异性为98.48%，阳性预测值97.87%，阴性预测值86.67%。细胞DNA定量分析检测恶性胸水敏感度为80.36%，特异度为90.91%，阳性预测值88.24%，阴性预测值84.51%。两种方法诊断结果一致性一般（Kappa=0.473，P<0.001），差异无统计学意义（P=1.0）。结论 DNA定量分析检测是一种较敏感而特异的肺癌的筛查技术，DNA异倍体有望作为良恶性胸水诊断有价值的标志物。
关键词：胸腔积液；细胞学检查；细胞DNA定量分析
中图分类号：R450 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.06.021
文章编号：1006-1959（2018）06-0066-04
Quantitative Analysis of DNA for Diagnosis of Pleural Effusion
WANG Min，JIANG Tao
（Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
Abstract：Objective To evaluate the value of DNA quantitative analysis in the diagnosis of unexplained hydrothorax.Methods A total of 122 patients with pleural effusion were collected from our hospital in September 2015～March 2016.After taking the tablets， they were stained by PAP staining and cytological examination.After Feulgen staining， cell DNA was quantitatively analyzed.Results There were 56 cases of malignant pleural effusion and 66 cases of benign pleural effusion in 122 cases of pleural effusion.The sensitivity of malignant pleural effusion was 82.14%，the specificity was 98.48%，the positive predictive value was 97.87%，and the negative predictive value was 86.67%.The sensitivity of DNA in malignant pleural effusion was 80.36%，the specificity was 90.91%，the positive predictive value was 88.24%，and the negative predictive value was 84.51%.The results of the two methods were consistent（Kappa=0.473， P<0.001），and the difference was not statistically significant（P=1.0）.Conclusion DNA quantitative analysis is a sensitive and specific screening technology for lung cancer.DNA aneuploidy is expected to be a valuable marker for the diagnosis of benign and malignant pleural effusion.
Key words：Pleural effusion；Cytological examination；Quantitative analysis of cell DNA
近年來，肺癌已成为全球最主要的癌症死亡原因，其总患病率为130.2/10万[1]。恶性胸腔积液为肺癌常见的并发症之一，约57%的肺癌患者在初诊时已发生了远处转移[2]。故胸腔积液的良恶性鉴别在临床上具有协助疾病诊断、指导治疗的意义。目前临床上鉴别良恶性胸腔积液常依靠胸水细胞学检查，其主要依靠细胞形态学进行定性诊断，但该检查对高度增生的间皮细胞、增生性间皮细胞，肿瘤的间皮细胞和转移性腺癌细胞的鉴别诊断较为困难[3]。目前采用液基细胞学检查（liquid-based cytology，LBC）行脱落细胞学检查，较传统涂片在病理学诊断阳性率有所提高[4]。本研究应用DNA定量分析（DNA image cytometry，DNA-ICM）检测胸腔积液中的细胞异倍体，并与脱落细胞学结果相对比，以探讨该检测方法在良恶性胸腔积液中的诊断价值。
1 材料与方法
1.1研究对象 收集本院2015年9月～2016年3月胸腔积液标本122例，其中男77例，女45例，年龄22～95岁，所有病例均经组织病理学、影像学、实验室检查并结合临床诊断明确。全部患者胸腔积液均同时行脱落细胞学检查和细胞DNA定量检测。
1.2方法 每例胸腔积液留取标本50 ml，离心涂片，根据不同检测方法制片。
1.2.1 DNA定量分析 标本中加入肝素抗凝，将标本静止30 min，弃去大部分上清液，取底层沉淀物高速离心后，留取沉淀物涂片，涂片经Feulgen染色后再经全自动细胞图像分析系统（由厦门麦克奥迪医疗诊断有限公司提供）进行扫描处理。对每张玻片上所有细胞核进行扫描测定，标准对照细胞为同张玻片上的正常细胞，并检测细胞核DNA含量。分析结果：采用DI（DNA Index，DNA指数）判定，正常细胞DI等于1，病变细胞DI≥2.5，1 1.2.2细胞学检查 留取标本行巴氏染色，制作3张细胞片，经病理科医生阅片后判定结果。诊断结果分为：①未见到癌细胞；②见到少许异型细胞；③见到重度不典型异型细胞；④可疑癌细胞；⑤见到癌细胞。 1.3统计学处理 采用SPSS Stastistics 22.0软件进行数据分析，率的比较应用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。同时计算灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。 2 结果 恶性胸腔积液56例，其中非小细胞肺癌33例包括腺癌29例 鳞癌3例，非小细胞肺癌未分型1例。小细胞肺癌8例，临床诊断肺癌3例。其他组系统肿瘤12例，包括肝癌1例，乳腺癌3例，盆腔恶性肿瘤1例，食管癌1例，腹膜癌1例，血液系统恶性肿瘤2例，胰腺癌1例，肾癌1例，直肠癌1例。良性胸腔积液66例。细胞学检查阴性者占61.48%（75/122），细胞学检查阳性者占38.52%（47/122）。DNA检查阳性者占41.80%（51/122），DNA检查阴性者占58.20%（71/122），见表1和图1。 2.1细胞DNA定量分析 以DI≥1作为阳性界值计算，122例胸腔积液脱落细胞学检查，56例恶性胸水中DI经分析后诊断为阳性的有45例，66例良性胸水中60例DI值呈阴性。细胞DNA定量分析鉴别良恶性胸腔积液的敏感度为80.36%，特异度为90.91%，见表2。 2.2细胞学检查 122例胸腔积液脱落细胞学检查，将见到少许异型细胞、重度不典型异型细胞、可疑癌细胞及癌细胞判定为阳性。56例恶性胸水检出阳性46例；66例良性胸腔积液中细胞学检查呈阳性1例，敏感度82.14%，特异性98.48%，见表2。 2.3 DNA定量检测与传统细胞学检查结果比较 以活检和临床证实的结果为金标准。在胸水脱落细胞学检查中，以不典型细胞、可疑癌细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的脱落细胞学检查的敏感度82.14%，特异性98.48%，阳性预测值97.87%，阴性预测值86.67%。细胞DNA定量分析检测恶性胸水敏感度为80.36%，特异度为90.91%，阳性预测值88.24%，阴性预测值84.51%。将两种检测方法的灵敏度结果进行配对卡方检验（McNemar"s test），敏感度无统计学差异[诊断结果一致性一般（Kappa=0.473，P<0.001）； 差别无统计学意义（P=1.0）]。 3讨论 目前，确诊晚期肺癌的常见方法有细胞学检查及通过有创检查获取病理组织。对于有胸腔积液但不能耐受相关有创操作检查的患者，获得组织标本存在一定难度且有较高风险，故细胞学检查在明确诊断时占较为重要的地位，但其结果受胸腔积液中细胞数量、细胞形态变化是否典型以及诊断医师的主观性判断影响，而细胞DNA定量分析技术是基于细胞核内DNA含量数值的客观判断，可识别标本中少数呈异倍体改变的细胞。DNA-ICM是目前较为成熟、客观的检测方法，通过分析细胞核内DNA含量，希望能早期判断细胞是否发生恶变。该方法已在宫颈癌、食管癌、乳腺癌等肿瘤中有较多研究[5-7]。且有研究表明，细胞DI值和异倍体细胞数的多少与细胞增殖、癌变程度及预后相关[7-9]。 正常细胞核内含有23对染色体，并有固定数量的DNA含量。细胞分裂周期由G1期、S期、G2期、M期组成。处于不同分裂周期中细胞的DNA含量有所差别，故其DI值有所不同。细胞分裂周期过程中DI值波动在1～2，二倍体细胞DI值为1，四倍体细胞DI值为2。 正常情况下，人体中大多数细胞为二倍体细胞，少数为异倍体细胞。由于基因丢失、突变、异常扩增或染色体移位、融合等导致细胞DNA含量增加，使细胞呈异倍体改变[10]。ICM-DNA定量分析系统结果评判结合了DI值与DNA定量分布两指标，DI值反映了细胞DNA平均含量的多少，具有较高精确度，而DNA定量分布在反应多个细胞的增殖状态及异倍体核型有较高灵敏度。 122例不明原因胸腔积液，其中56例恶性胸水均经病理诊断及随访明确，经DNA检测出阳性45例，细胞学检查阳性46例，经配对？字2检验两种检测方法检测结果一致，一致性一般。本试验结果示DNA-ICM对肺恶性胸腔积液的灵敏度（80.36%）與周箴[11]报道的DNA定量分析在恶性胸水诊断的灵敏度（77.8%）较一致。经细胞学检查为阳性的46例标本中，DNA分析其中41例为阳性，这可能是由于部分肿瘤为二倍体肿瘤，其肿瘤细胞无异倍体出现，故DNA-ICM结果为阴性。56例恶性胸水中有6例细胞学检查及DNA定量检测均为阴性（3例为小细胞肺癌，2例为腺癌，1例为临床诊断肺癌），存在一定的漏诊率，考虑其漏诊原因与以下原因相关：①小细胞肺癌引起胸腔积液原因常与肿瘤压迫淋巴致淋巴回流障碍相关，而非肿瘤侵犯胸膜；②部分肿瘤患者合并有多种基础疾病，如肝硬化、低蛋白血症、心力衰竭，从而出现胸腔积液；③其胸腔积液中细胞数过少。56例恶性胸腔积液中有4例细胞学检查呈阴性，但DNA定量结果为阳性。考虑可能与细胞癌变时DNA的含量变化较细胞形态学变化较早有关。
在恶性肿瘤的发生和进展过程中，均可侵及胸膜引起恶性胸腔积液[12]。而不同来源的转移肿瘤细胞在形态学上有着不同表现，故通过常规细胞学检查诊断转移性肿瘤存在一定难度。本试验中56例恶性胸水，其中肺外转移性肿瘤占12例。肺外转移肿瘤侵及胸膜的细胞学阳性率为50.00%（6/12），ICM-DNA阳性率为75.00%（9/12），提示ICM-DNA在肺外转移性肿瘤检出率上有所提高，该检查方法对以胸腔积液为首发症状的肺外转移肿瘤患者存在一定的指导意义。
本试验采用的细胞学检查手段为液基细胞学，该制片方法具有简单、易操作，可以去除标本中干扰结果的红细胞、黏液及炎细胞，以获得较高质量且数量足够的细胞。同时因其制片为程序化，可重复性好，避免人为因素致细胞挤压出现肿瘤假象影响检查结果[13]。有研究示，LBC在肺癌胸腔积液中的检出率优于传统涂片[14]。既往有多个研究[15，16]报道ICM-DNA在不明显原因胸水中的阳性检出率较传统细胞涂片检查高，但本试验结果表明，ICM-DNA与LBC两种检测方法检测结果一致，可能与细胞学检查方法改进有关。
细胞学检查结果受病理医师主观评价影响较大，而ICM-DNA较胸水细胞学检查操作简单，重复性好，受操作者影响因素较少，为一客观评价指标，灵敏度及特异度较高，DNA含量的测定为诊断恶性肿瘤提供了除细胞学形态以外的特有的生物学信息，弥补了形态学的不足，提高不明胸腔积液的阳性检出率。且有研究表明，细胞DNA定量检测在痰液、纤维支气管镜刷片及支气管肺泡灌洗液涂片等不同来源标本诊断肺癌时敏感度均较高于细胞学检查[17-19]。因而细胞DNA定量检测有望成为恶性胸水诊断的标志物。
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收稿日期：2018-3-5；修回日期：2018-3-21
编辑/成森